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氧化苦参碱通过ERK途径影响SGC7901胃癌细胞增殖的作用机制

2013-10-09王俊霞王超吕品田

河北医药 2013年1期
关键词:苦参碱抑制率培养液

王俊霞 王超 吕品田

胃癌是临床常见的肿瘤疾病之一,传统的放疗和化疗对晚期胃癌达不到令人满意的疗效,抗肿瘤细胞增殖的药物被认为是比较有前途的抗癌药物。氧化苦参碱(OXY)是中药苦参的主要生物碱之一,研究表明,OXY在体外能抑制人的胰腺癌[1]、卵巢癌[2]等多种肿瘤细胞的生长,但OXY对胃癌细胞增殖的作用及机制笔者尚未见报道。本研究旨在观察OXY对人胃癌SGC7901细胞增殖、增殖相关因子PCNA的影响,并探讨OXY调控PCNA抗肿瘤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:人胃癌敏感细胞株SGC7901购自中科院上海细胞所。

1.1.2 主要试剂:氧化苦参碱(OXY)购自宝鸡永嘉天然植物开发有限公司;磺酰罗丹明(SRB)购自IL公司;PD98059购自Sigma公司;p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)抗体购自Cell Signaling Technology公司;PCNA、GAPDH引物由上海生工生物技术公司合成,PCNA(302 bp):5’-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3’(上 游),5’-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3’(下游);GAPDH(452 bp):5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(上游),5’-TCCACCACCCTGTTGCTG-3’(下游)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:SGC7901细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640中,于5%CO2,37℃恒温培养箱中常规培养,取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 SRB法检测OXY的细胞毒性:取对数生长期的SGC7901细胞分组实验,每组设6个复孔,实验组加入OXY(使终浓度分别为1.0、2.0、4.0 mg/ml);对照组加入等体积的培养液。作用48 h后进行SRB法,酶标仪545 nm处测定每孔OD值,计算细胞生长抑制率。抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 流式细胞术(FCM)测定细胞周期:SGC7901细胞加入1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY作用48 h,对照组加入等体积培养液,收集细胞,流式细胞仪检测。

1.2.4 OXY对SGC7901细胞PCNA表达的影响:SGC7901细胞分为OXY组(4.0 mg/ml OXY)和对照组(培养液),作用48 h后收集细胞,实时荧光定量PCR(QPCR)检测PCNA mRNA的表达,扩增完成后,将对照组设为1,以PCNA/GAPDH的比值RQ用于统计分析;蛋白质印迹(Western blot)法检测PCNA蛋白的表达,最后以PCNA光密度值/GAPDH光密度值的比值作为PCNA的相对蛋白表达水平。

1.2.5 OXY 对 SGC7901细胞 p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白表达的影响:SGC7901细胞分为OXY组(4.0 mg/ml OXY)和对照组(培养液),作用48 h后收集细胞,Western blot检测 p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白的表达。

1.2.6 阻断ERK通路时OXY作用的SGC7901细胞中PCNA蛋白表达的影响:SGC7901细胞分为:OXY组(4.0 mg/ml OXY)、OXY+ERK抑制剂PD98059干预组(PD组,20μmol/L PD98059作用1 h后再加入4.0 mg/ml OXY继续培养48 h)和对照组(培养液)。收集细胞,Western blot检测PCNA、ERK、p-ERK蛋白的表达。

1.3 统计学分析应用SPSS11.5统计软件,计量资料以±s表示,采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OXY对胃癌SGC7901细胞抑制率的影响 OXY对胃癌SGC7901细胞有抑制作用,1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY抑制率分别为(14±4)%、(49±6)%、(67±9)%,可见随着OXY浓度增大,抑制率明显上升。

2.2 OXY对胃癌SGC7901细胞周期的影响 与对照组比,1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY 处理 SGC7901细胞后,G1期的细胞均显著增加(P<0.05或<0.01),S期细胞明显减少(P<0.01)。见表1。

表1 OXY对胃癌SGC7901细胞周期分布的影响n=6,%,±s

表1 OXY对胃癌SGC7901细胞周期分布的影响n=6,%,±s

注:与对照组比较,*P <0.05,#P <0.01

2.0 75±11# 10.9±2.2# 14±4 4.0 76±12# 8.6±1.4#15±3

2.3 OXY对胃癌SGC7901细胞PCNA表达的影响 4.0 mg/ml OXY处理细胞48 h后,OXY组细胞PCNA mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05或<0.01)。见表2。

表2 OXY对胃癌SGC7901细胞PCNA表达的影响n=3,±s

表2 OXY对胃癌SGC7901细胞PCNA表达的影响n=3,±s

注:与对照组比较,*P <0.05,#P <0.01

OXY组 0.32±0.010.24±0.03

2.4 OXY对胃癌SGC7901细胞p38MAPK、JNK、ERK及磷酸化的影响 经4.0 mg/ml OXY处理48 h细胞后ERK的磷酸化受到明显抑制,与对照组比差异有统计学意义(P<0.05),但ERK蛋白表达、p38MAPK、JNK及磷酸化表达均无明显变化(P>0.05)。见表3。

表3 OXY对胃癌SGC7901细胞p38MAPK、JNK、ERK蛋白的表达n=3,±s

表3 OXY对胃癌SGC7901细胞p38MAPK、JNK、ERK蛋白的表达n=3,±s

注:与对照组比较,*P<0.05

OXY组 0.39±0.08 0.59±0.07 0.69±0.09 0.41±0.05 0.42±0.05 0.42±0.06*

2.5 阻断ERK通路时OXY作用的SGC7901细胞中PCNA蛋白表达变化 与对照组比较,OXY组PCNA、p-ERK表达均明显下降(P<0.05),预先加入ERK抑制剂PD98059的PD组与OXY组比较,PCNA表达明显上升(P<0.05),p-ERK的水平进一步下降(P<0.05),表明ERK抑制剂PD98059可以协同OXY抑制p-ERK的表达。见表4。

表4 3组细胞中PCNA、ERK、p-ERK的表达变化n=3,±s

表4 3组细胞中PCNA、ERK、p-ERK的表达变化n=3,±s

注:与对照组比较,*P <0.05;与OXY组比较,#P <0.05,△P <0.01

PD组 0.58±0.110.43±0.05 0.21±0.03

3 讨论

OXY具有广泛的药理活性,具有抗菌、抗病毒的作用,最近其抗肿瘤及耐药性[3]的作用也逐步引起人们的关注。OXY能通过抗增殖的作用抑制卵巢癌等细胞的生长,我们的SRB实验发现OXY尚能抑制人胃癌SGC7901细胞增殖,其浓度及抑制率与张琼等[2]在卵巢癌中的报道基本一致。

细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体自身的稳定,细胞周期的异常会导致这一系列过程的紊乱,导致肿瘤的发生。观察到OXY可使胃癌细胞周期发生变化,G1期细胞均显著增加,S期细胞明显减少。蛋白PCNA的表达与细胞周期密切相关,能够反映细胞增殖分数和所处的周期[4],本结果显示OXY能够下调PCNA的表达,从而发挥抗肿瘤增殖的作用。

MAPKs信号通路是细胞赖以接受外界刺激信号并作出相应反应的重要传导通路,参与了细胞增殖、分化、凋亡等过程[5]。本结果显示OXY干预SGC7901细胞后,ERK的磷酸化水平明显下降,但ERK蛋白表达、p38MAPK、JNK及磷酸化表达均无变化。ERKs信号通路与细胞的增殖分化密切相关[6],本实验中,预先加入ERK抑制剂PD98059[7]可以协同OXY抑制p-ERK的表达,提示OXY能通过抑制MAPK/ERK信号通路中的关键信号分子ERK的磷酸化而抑制胃癌细胞的增殖过程。综合 OXY对细胞周期的影响结果,推测 OXY调控SGC7901细胞增殖可能的途径为:抑制ERK磷酸化→G1期CDK复合物减少→S期抑制因子增多→细胞增殖阻滞于S期→细胞停止增殖→PCNA表达下降。这一途径的阐明,为开发胃癌治疗药物提供了实验依据。

1 冀润利,邸瑶,夏时海,等.氧化苦参碱对SW1990细胞MMP-2表达的抑制作用及对细胞侵袭力的影响.世界华人消化杂志,2011,19:19-24.

2 张琼,潘平东.氧化苦参碱对人卵巢癌HO-8910细胞的作用及其机制的初步研究.医学信息,2010,23:3381-3383.

3 吕建裕,赵瑛.氧化苦参碱逆转MCF-7/ADM耐药的研究.中国现代医生,2010,48:86-87.

4 Czyzewska J,Guzińska-Ustymowicz K,Pryczynicz A,et al.Immunohistochemical evaluation of Ki-67,PCNA and MCM2 proteins proliferation index(PI)in advanced gastric cancer.Folia Histochem Cytobiol,2009,47:289-296.

5 Shigematsu H,Yoshida K,Sanada Y,et al.Rapamycin enhances chemotherapy-induced cytotoxicity by inhibiting the expressions of TSand ERK in gastric cancer cells.Int J Cancer,2010,126:2716-2725.

6 Lo HW.Targeting Ras-RAF-ERK and its interactive pathways as a novel therapy for malignant gliomas.Curr Cancer Drug Targets,2010,10:840-848.

7 Rasola A,Sciacovelli M,Chiara F,et al.Activation of mitochondrial ERK protects cancer cells from death through inhibition of the permeability transition.Proc Natl Acad Sci U SA,2010,107:726-731.

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