金雀异黄素对骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞前后蛋白和Ca2+浓度变化的研究

潘国强 齐凤平 王相利

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是存在于骨髓中非造血干细胞的另一种具有多分化潜能的干细胞。因具有强大的增殖能力和多向分化潜能，MSCs成为现代生物学和医学领域研究的热点。2000年 Woodbury等［1］首次将MSCs在体外诱导分化为外胚层起源的神经元样细胞。随后，国内外均有实验证明了这一点，这为临床神经系统疾病的细胞治疗开启了一片光明［2］。但对于MSCs诱导分化为神经元样细胞的确切机制目前还不清楚。金雀异黄素(Genistein)是一种异黄酮类的植物雌激素，在蚕豆中广泛分布，具有弱雌激素的生物活性，是一种特异性的酪氨酸蛋白激酶抑制剂，Ca2+作为细胞内第二信使参与许多生命活动过程，如细胞代谢、增殖等。为探讨使用金雀异黄素阻断酪氨酸激酶能否对细胞内Ca2+有影响及金雀异黄素对MSCs分化为神经元样细胞过程中细胞内相关蛋白有无变化，本试验进一步研究骨髓间充质干细胞诱导分化的机制。报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 培养细胞、免疫组化和激光扫描共聚焦显微镜实验在华北煤炭医学院中心实验室完成。实验用材料:L-DMEM培养基(Sigma)、胎牛血清 FBS(Hyclone)、Percoll分离液(Sigma)、胰蛋白酶(Amersco)、DEPC(Amersco)、Trizol(invitrogen)、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1．2 方法

1．2．1 骨髓间充质干细胞的分离和培养:取健康成年SD大鼠(雄性，150～200 g，清洁级，由中国药物检定所动物中心提供)，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，用含10%FBS的LDMEM，反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓后充分混匀，离心后弃上清及脂肪层，沉淀用L-DMEM培养基混匀，轻轻叠加到密度为1．073 g/ml的Percoll分离液上，离心后取乳白色单核细胞层(中间界面层)，再用L-DMEM混匀离心洗涤两次，细胞沉淀中加入 L-DMEM(含10%FBS)，记数细胞，调整密度，按1×109密度接种于一次性塑料培养瓶中，置于CO2孵箱中培养，48 h后首次换液，弃掉未贴壁细胞。以后每3天换1次液。待培养的细胞增殖接近融合状态时，用0．25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代培养。倒置相差显微镜观察不同时期细胞生长情况。

1．2．2 骨髓间充质干细胞的诱导分化:细胞传至第5代，待细胞融汇成致密单层后，去除培养液，以0．01 mol/L PBS(pH值7．4)冲洗3 次，加入预诱导液(L-DMEM、1 mmol/Lβ-巯基乙醇、20%FBS)，进行预诱导，24 h后去除预诱导液，0．01 mol/L PBS冲洗3次，加入诱导液(L-DMEM、5 mmol/L β-巯基乙醇)，诱导培养5 h，并在倒置相差显微镜下进行观察、照相。

1．2．3 免疫组化技术检测:将18 mm×20 mm的盖玻片放在6孔板中，待细胞融汇成致密单层后，去除培养液，同步化24 h，加入浓度分别为0、25、50、75和 100 μmol/L 的金雀异黄素(诱导前后各10个样本)，37℃培养箱中培养24 h，吸去培养液，PBS洗2次，按照Woodbury经典诱导方案进行诱导，诱导前后细胞用4%多聚甲醛固定，按SABC法检测生长相关蛋白-43(Growth Associated Protein，GAP-43)、神经元烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神经丝(neurofilament，NF)和巢蛋白(Nestin)诱导前后的蛋白表达。光镜下观察，以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，未着色为阴性。选择5～10个高倍镜视野，采用生物医学图像分析系统随机计数200个细胞，阳性细胞率=(阳性细胞数/200)×100%。

1．2．4 激光扫描共聚焦显微镜技术检测:细胞传至第四代，细胞消化后传至共聚焦专用培养皿中(诱导前后各6个样本)，待细胞融汇成致密单层后，去除培养液，同步化24 h，加入浓度分别为 0、25、50、75 和100 μmol/L 的金雀异黄素，37 ℃ 培养箱中培养24 h，吸去培养液，用含有1 mmol/L的β-巯基乙醇，20%胎牛血清的 L-DMEM进行预诱导，24h后去除预诱导液，0．01 mol/LPBS(pH 值 7．4)冲洗 3 次，加入含有 10 μmol/L Fluo-3/AM的L-DMEM培养液负载45 min，每隔10 min轻轻吹打，避光，45 min 后，0．01 mol PBS(pH 值 7．4)冲洗 3 次，加入诱导液(L-DMEM、5 mmol/L β-巯基乙醇)进行诱导培养，并在激光扫描共聚焦显微镜下进行观测细胞形态和荧光强度的变化。利用分析软件对数据化图像进行分析，以参数平均灰度代表细胞内Ca2+浓度变化。

1．3统计学分析应用SPSS 11．5统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 MSCs培养、诱导分化 加入预诱导液24 h后MSCs细胞体积缩小，立体感增强，细胞边缘变得不规整，部分细胞有细的指状突起，其中约2%的MSCs胞体已变成近似球形，具有短的突起，形状类似神经元。在加入诱导液后约10 min，观察到细胞形态开始发生变化，胞体回缩，变得致密有折光性，向外伸出突起。约30 min后，部分细胞向具有神经细胞形态特点的细胞转化，扁平的胞浆向胞核进一步收缩，细胞体逐渐变成圆形或锥形，折光性增强，胞体周围具有较强的光晕，胞体伸展的突起继续延长。以后随时间进展，1 h、5 h具有神经细胞形态特点的细胞数量逐渐增多，形成双极或多极细胞，而且细胞的多个突起发出分支，相互交织成网。到5 h后MSCs转化达到峰值，形态也不再发生明显改变，具有典型的神经细胞样形态。

2．2 免疫组化结果 0、25、50、75 和 100 μmol/L 的金雀异黄素培养骨髓间充质干细胞24 h及诱导后，随着金雀异黄素浓度的增加，GAP-43、NSE、NF和Nestin的阳性细胞率即蛋白水平逐渐增加，25、50、75 和 100 μmol/L 的金雀异黄素 4组与0 μmol/L的金雀异黄素组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。见图 1、2，表 1。

图1 0 μmol/L金雀异黄素诱导前MSCs NSE阳性细胞(SP×100)

图2 0 μmol/L金雀异黄素诱导后MSCsNSE阳性细胞(SP×100)

表1 不同浓度金雀异黄素作用骨髓间充质干细胞前后免疫组化结果

2．3 激光扫描共聚焦显微镜观察结果 MSCs负载荧光探针Fluo-3/AM 45 min后，固定放置在激光扫描共聚焦显微镜37℃载物台上，0．01 mol PBS(pH 值7．4)洗3次，加入诱导液(L-DMEM、5 mmol/L β-巯基乙醇)无血清培养液。从加诱导剂时开始在488 nm激光下扫描观测细胞形态和荧光强度的变化。利用分析软件对数据化图像进行分析，以参数平均灰度代表细胞内Ca2+浓度变化。更换诱导液后，各组细胞内荧光强度逐渐增加，到100 s达高峰值，其后逐渐减弱，但20 min时细胞荧光强度仍高于诱导前，此时可见MSCs开始向神经元样细胞分化，但是随着金雀异黄素浓度的增加，［Ca2+］i浓度增加的幅度明显降低(P ＜0．05)。见图3～5。

图3 0 μmol/L金雀异黄素诱导前MSCs细胞荧光图象(SP×200)

图4 0μmol/L金雀异黄素诱导后MSCs细胞荧光图象(SP×200)

图5 骨髓间充质干细胞诱导分化前后细胞荧光强度的变化

3 讨论

骨髓间充质干细胞来源于中胚层，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中亦可分离得到。MSCs易于贴附于塑料培养板表面，有自我更新和增殖的能力，具有多向和横向分化的能力，可分化为3个胚层来源的多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和肝卵圆细胞等。MSCs取材方便，易于培养，遗传背景稳定，自体移植无明显免疫排斥反应，不涉及伦理道德等问题，并且易于被外源基因转染并稳定表达，因而被认为是组织工程理想的种子细胞。应用β-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol，BME)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和4-羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)等作为诱导剂，在体外成功地诱导成年大鼠和人的MSCs分化为神经元样细胞和胶质细胞，这为临床神经系统疾病的细胞治疗开启了一片光明［3，4］。

金雀异黄素(Genistein)是一种异黄酮类植物雌激素，在蚕豆中广泛分布，具有弱雌激素的生物活性，是一种特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂［5］。在本次试验中，骨髓间充质干细胞按照Woodbury方案进行诱导成神经元样细胞后，通过免疫组化证实GAP-43、NSE、NF、Nestin蛋白水平明显增加，并具有典型的神经细胞样形态。随着金雀异黄素浓度增加，诱导后GAP-43、NSE、NF、Nestin蛋白水平亦明显增加，说明金雀异黄素对骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞可能有促进作用。

钙离子几乎调控机体所有的生理活动，细胞受刺激后，通过细胞信号转导通路引起细胞内钙池Ca2+释放和细胞外Ca2+内流，二者都引起胞浆［Ca2+］i升高，其中细胞外Ca2+内流是引起细胞内［Ca2+］i持续升高的关键因素。Ca2+作为细胞内信使发挥作用，其绝对浓度并不是很重要，而其时-空特性在细胞内信号转导中的作用越来越受到重视［6］。

激光共聚焦扫描显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的一种高尖设备，这一技术也称之为“细胞断层扫描”即细胞CT［7］。Fluo-3/AM是Fluo-3的酯化形式，可透过细胞膜进入细胞，其已酰羟甲基酯(AM)形式无荧光，游离态也无荧光，Fluo-3/AM在细胞内被酯酶水解成Fluo-3，Fluo-3与游离钙结合后荧光增强50～100倍，为所有钙荧光探针中变化最大者。Fluo-3产生的荧光强度与细胞内游离钙离子的浓度成正比，荧光强度的变化可指示游离钙离子的相应变化。Fluo-3可用488 nm氩激光激发，适用于激光扫描共聚焦显微镜。pH值为7．0以上时对其不敏感，对Mg2+也不敏感，故测量结果不宜受这些因素的干扰，故此fluo-3/AM是最佳的用于激光光源的荧光染料。

在本次实验中，各组骨髓间充质干细胞按照Woodbury经典诱导方案进行诱导，细胞内荧光强度逐渐增加，到100 s达高峰值，其后逐渐减弱，但20 min时细胞荧光强度仍高于诱导前，此时可见MSCs开始向神经元样细胞分化，但随着金雀异黄素浓度的增加，Ca2+i浓度各组同时间增加的幅度明显降低。Ca2+作为细胞内重要第二信使，在Woodbury经典诱导过程中可能不起关键性作用。

骨髓间充质干细胞按照Woodbury方案进行诱导分化成神经元样细胞是否可能导致细胞内一系列反应，启动MSCs的神经元发育和分化基因表达，以及MSCs的细胞骨架(微丝、微管和中间丝)重排，导致细胞伸出细长突起，部分相邻的细胞突起连接成网状，表达神经元特异标志物如GAP-43、NSE、NF、Nestin等，从而MSCs分化为神经元样细胞，具体机制有待进一步研究。

1 Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al．Adult rat and human marrow stromal cells differentiate into neurons．J Neurosci Res，2000，61:364-370．

2 Novikova LN，Brohlin M，Kingham PJ，et al．Neuroprotective and growthpromoting effects of bone marrow stromalcells after cervical spinal cord injury in adult rats．Cytotherapy，2011，13:873-887．

3 Schwarz SC，Schwarz J．Translation of stem cell therapy for neurological diseases．Transl Res，2010，156:155-160．

4 Matsuse D，Kitada M，Kohama M，et al．Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells differentiate into functional Schwann cells that sustain peripheral nerve regeneration．J Neuropathol Exp Neurol，2010，69:973-985．

5 Ma HP，Ming LG，Ge BF，et al．Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro．J Cell Biochem，2011，112:916-923．

6 Fischer W，Nrenberg W，Franke H，et al．Increase of intracellular Ca2+by P2Y but not P2X receptors in cultured cortical multipolar neurons of the rat．J Comp Neurol，2009，516:343-359．

7 Arrasmith CL，Dickensheets DL，Mahadevan-Jansen A．MEMS-based handheld confocal microscope for in-vivo skin imaging．Opt Express，2010，18:3805-3819．