EGB对大鼠局灶性脑缺血－再灌注中小胶质细胞的影响

王淑英，邬 剑，李 尧，王景霞，张 辉，李 文，齐亚灵，李慧玲

（1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007；2.佳木斯妇幼保健院，黑龙江 佳木斯154003；3.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯154003）

近些年来人们发现，在中枢神经系统中小胶质细胞参与免疫反应[1]。小胶质细胞在脑缺血后变得异常活跃，缺血性脑损伤以后小胶质细胞的反应极复杂，已超出了清除变性坏死组织和对神经元的营养作用的范围[2]。本实采用大鼠局灶性脑缺血－再灌注模型，探讨银杏叶提取物（Extract of Ginkgo biloba，EGB）对缺血－再灌注中小胶质细胞的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

成年Wistar大鼠72只，体重280～380g，随机分为假手术组：只做分离动脉手术，大脑中动脉不栓塞；缺血－再灌注组，栓塞大脑中动脉2h，再灌注24h；EGB治疗组：栓塞大脑中动脉2h，栓塞2min内进行尾静脉注射EGB（20mg／kg），再灌注24h内，给药共3次。每组24只。手术前12h禁食，可自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 栓子的制备

将一根直径0.23mm、长35mm的尼龙钓鱼线的一端均匀地涂上一层聚胺酯，使其直径达到0.25～0.26mm，晾干待用。

1.2.2 大鼠局灶性脑缺血－再灌注模型的制备

采取颈内动脉插入线法造模[3～5]。Wistar大鼠用3.5%水合氯醛（350mg／kg）麻醉，仰卧固定。切开颈部正中皮肤，游离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），仔细分离避免刺激迷走神经。由CCA分叉处向头端依次游离，用电热烧灼器烧断颈外动脉所有分枝，使其主干游离。然后分离ICA至颅底，并分离出ICA颅外段的唯一分支翼腭动脉（PPA）。用蛙心夹夹住CCA和ICA，并在ECA（靠近CCA分叉处）上剪一小口，将制好的栓子（预先蘸有肝素钠溶液）沿切口插入ECA，经CCA分叉处并将预先放置于ECA根部的手术缝合线缚紧，防止栓子滑出和出血，然后放开ICA上的蛙心夹，将栓子缓慢地向ICA入颅方向推进约19～21mm，微遇阻力即停，使栓子头端停留在大脑中动脉（MCA）与大脑前动脉（ACA）分叉处。固定好栓子，即完成一侧MCA的栓塞。栓塞2h后，缓慢的轻拉栓子使其头端回到ECA内，即可实现MCA再灌注。

1.2.3 EGB干预

术后2min尾静脉给药，20mg／kg，每天3次。

1.2.4 神经病学评分

参考Kuluz[6]神经缺陷三级评分的标准，动物清醒后分别在对应时间点进行评分。符合条件的大鼠才可进入下一步试验。

1.3 小胶质细胞的检测

1.3.1 硝酸银染色法

染色步骤：（1）组织固定于FAB液（溴化铵－福尔马林）；（2）冰冻切片20μm；（3）在含有数滴氨水的蒸馏水中洗30s；（4）蒸馏水洗2次；（5）浸碳酸银液体30s；（6）10%福尔马林还原；（7）蒸馏水洗；（8）0.2%氯化金调色10min；（9）蒸馏水洗；（10）5%次亚硫酸钠固定5min；（11）蒸馏水洗；（12）脱水、透明、封固。

1.3.2 S－100蛋白表达检测－SABC

步骤如下：（1）冰冻切片，载玻片防脱片处理：经Polylysine防脱片处理。（2）低温恒冷切片机大鼠脑连续切片厚20μm。捞于Poly－lysine防脱片处理载玻片。（3）纯丙酮室温固定30min。蒸馏水洗。（干燥后冰冻保存）。（4）纯甲醇加H2O2至0.3%，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。0.1MPBS洗2min×3次。（5）滴加正常山羊血清封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗。（6）滴加适当稀释的一抗S－100（一抗的稀释度1：1000.1M PBS稀释），4℃过夜。0.1MPBS洗，2min×3次。（7）滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20min。0.1MPBS洗2min×3次。（8）滴加 HIGH－SABC，37℃20min。0.1MPBS洗5min×4次。（9）DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。（10）苏木素轻度复染。脱水、透明、封片。显微镜观察。

1.4 统计学处理

采用SPSS软件处理，组间采用方差分析，组内采用独立样本t检验。所有数据以均值±标准差表示，显著性差异水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 小胶质细胞AgNO3染色观察

假手术组小胶质细胞胞体较小，突起比较长（图1）；缺血2h再－灌注24h组，在神经细胞严重损害的梗死区边缘，小胶质细胞肥大、增生，而在含散在萎缩神经元的梗死毗邻区域出现圆状、阿米巴状、杆状小胶质细胞（图2）；EGB治疗组与缺血2h再灌注24h组比较细胞数量多，突起较长（图3）。

图1 假手术组AgNO3染色400×

2.2 小胶质细胞S－100免疫组化染色观察

缺血2h再灌注24h组小胶质细胞S－100阳性细胞数量与假手术组（图4）相比明显增多，小胶质细胞增生（图5）；EGB治疗组S－100阳性细胞数介于假手术组与缺血2h再灌注24h组之间（图6）。

图2 缺血－再灌注组AgNO3染色400×

图3 EGB治疗组AgNO3染色400×

图4 假手术组S－100阳性细胞100×

图5 缺血－再灌注组S－100阳性细胞100×

图6 EGB治疗组S－100阳性细胞100×

3 讨论

几十年来人们对EGBCNS的作用进行了大量的研究，表明EGB对CNS的保护作用明显，能促进神经元的可塑性，保护神经元的缺血损伤。但脑缺血－再灌注后EGB对小胶质细胞的影响少见报道。小胶质细胞在CNS损伤时能转变为有吞噬能力的小胶质细胞，清除坏死的细胞及结构损伤的髓鞘，在免疫应答的过程中发挥关键作用。脑缺血－再灌注后缺血损害区的小胶质细胞被激活，其形态表现为圆形、阿米巴状、杆状，并分化、增殖，S－100蛋白表达增强，形态的变化表明其已转化为具有吞噬能力的小胶质细胞，参与病理生理过程，本实验中缺血2h再灌注24h组结果与其一致。小胶质细胞吞噬清除病原体和细胞碎片以及分泌抗炎物质、神经生长因子等，有利于神经元再生和死亡周边区神经元的存活，发挥神经营养作用。但有实验表明被激活的小胶质细胞对CNS也具有损伤作用，即激活的小胶质细胞可产生一些细胞因子，然后细胞因子如IL－1又可进一步刺激小胶质细胞产生更多的神经毒性自由基以及炎症因子，对CNS产生损伤。因神经元不能再生，其损伤作用显然更为有害。本实验结果显示大鼠脑缺血－再灌注后小胶质细胞被激活，增生、肥大，S－100蛋白表达增加，EGB治疗组与缺血2h再灌注24h组比较细胞数量减少，突起较长，S－100阳性细胞表达减弱，表明EGB可抑制小胶质细胞过度激活，减轻其对CNS的进一步损伤，从而对脑组织起到保护作用。

[1]Gehrmam J，Matsumoto Y，Kreutzberg GW.Microglia：intrinsic immuneffector cell of the brain[J].Brain Res Rev，1995，20：269－287

[2]刘士民，郭玉璞.脑缺血的胶质细胞反应[J].国外医学：脑血管疾病分册，1999，7（2）：67－70

[3]王淑英，李慧玲，李文，等.EGB对大鼠脑缺血－再灌注损伤的作用[J].中国实用医药，2012，7（9）：244－246

[4]王淑英，斗章，姜晓艺，等.银杏叶提取物对大鼠局灶性脑缺血－再灌注损伤的神经保护作用[J].中国老年学杂志，2012，32（12）：2539－2540

[5]王淑英，王小江，金维哲，等.银杏叶提取物（EGB）对大鼠局灶性脑缺血再灌注后SOD活性和MDA含量的影响[J].黑龙江医药科学，2004，27（6）：29

[6]Kuluz JW，Prado RJ，Dietrich D，et al.The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats[J].Stroke，1993，24：2023