川芎嗪对人肝癌HepG2细胞的影响及与突变型p53蛋白表达的影响

张加军 邢国辉 王继伟 韩培香 李艳萍

（1 山东省日照市中医医院，日照276800；2 山东省五莲县人民医院，日照262300；3 山东省五莲县叩官中心卫生院，日照262305）

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，化疗在肝癌的综合治疗中起着重要作用，但由于多种原因导致肿瘤耐药性的发生，导致化疗失败［1－2］。川芎嗪 （tetramethypyrazine，TMP）是从中药川芎中提取的生物碱，它具有多种生物学活性，近年来研究发现其具有抗肿瘤和逆转肿瘤多药耐药的作用［3－4］。p53基因是人类恶性肿瘤最常见的突变基因，一旦p53基因发生突变，其不仅丧失抑癌功能，反而具有了癌基因活性，能促使细胞恶性转化［5－6］。因此，探索治疗肝癌的有效靶向药物及相关机制成为目前研究的热点。本研究将不同浓度的川芎嗪作用于含有突变型p53的人肝癌HepG2细胞，以观察川芎嗪对HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其与突变型p53表达变化的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人肝癌细胞株HepG2购自山东省医学科学院。川芎嗪注射液购自黑龙江哈尔滨医大药业有限公司。Hoechst32258荧光染色试剂盒购于美国Sigma公司。DMEM培养基、MTT均购自美国Gibco公司。胎牛血清 （杭州四季青），突变型p53抗体及PV－9000免疫组化试剂盒均为北京中山金桥生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2接种于含10%胎牛血清、青霉素、链霉素各l×105u／L的DMEM培养液中，置37℃，5%CO2培养箱内常规传代培养。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率 实验分组：取对数生长期的人肝癌HepG2细胞，按照3×107／L的密度接种于96孔培养板，每孔体积为200μl。待细胞贴壁后分别加入川芎嗪 （终浓度100、200、400、800mg／L），并设阴性对照组 （细胞正常生长组），每个浓度组设5个复孔，四周加入不含药物的细胞培养液为空白对照。分别培养24、48、72h后，每孔加入5g／L的MTT溶液20μl，继续培养4h，轻轻吸尽上清液，加入二甲基亚砜150μl／每孔，振荡10min，在酶标仪上以490nm波长测每孔的光密度值A，并取5孔的平均值，细胞生长抑制率＝（对照孔A值－实验孔A值）／对照孔A值×100%。

1.2.3 Hoechst染色法检测细胞凋亡率 实验分组：取对数生长期的HepG2细胞制成2×108／L的细胞悬液，每孔0.5ml，加入放有盖玻片的24孔板内。待细胞贴壁后分别加入川芎嗪 （终浓度100、200、400、800mg／L），并设阴性对照组 （细胞正常生长组），每个浓度组设5个复孔，培养24、48、72h后，取出细胞爬片，甲醇／冰醋酸固定液固定5min后，加入荧光染液Hoechst33258重悬细胞，室温避光1h，PBS冲洗，用抗荧光液封片。判定标准：正常细胞核为蓝色，凋亡的细胞核为白色。每片连续观察10个细胞分布均匀的200倍镜视野，每视野计数50个细胞，共500个细胞，计算其阳性率百分数，并取其均值。凋亡率＝凋亡细胞数／（正常细胞数＋凋亡细胞数）。

1.2.4 免疫细胞化学二步法观察HepG2细胞的表达 取对数生长期的HepG2细胞制成2×108／L的细胞悬液，每孔0.5ml，加入放有盖玻片的24孔板内，设对照组及不同浓度川芎嗪组，待细胞贴壁后分别加入川芎嗪 （终浓度100、200、800mg／L），48h后取出细胞爬片，冷丙酮固定5分钟，PBS冲洗，按PV－9000试剂盒步骤检测突变型p53，DAB显色，脱水，透明，中性树胶封片。用已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：突变型p53阳性结果为胞核内有棕黄色颗粒出现。采用HPAIS－1000高清晰度彩色病理图文分析系统，检测突变型p53阳性细胞的平均吸光度值 （A值），以间接反映突变型p53蛋白的表达量，并取其均值。

2 结果

2.1 不同浓度川芎嗪对HepG2细胞增殖的抑制作用 不同浓度川芎嗪作用于HepG2细胞24h、48h和72h后，细胞增殖抑制率显著高于对照组 （F＝148.392，271.152，346.513，均P＜0.01）；川芎嗪呈时间剂量依赖性地抑制HepG2细胞的增殖，同一浓度作用48h其增殖抑制率显著高于24h，作用72h又显著高于48h（均P＜0.01，表1）。

表1 不同时间浓度川芎嗪对HepG2细胞增殖活性的影响 （±S，n＝5）

表1 不同时间浓度川芎嗪对HepG2细胞增殖活性的影响 （±S，n＝5）

注：b P＜0.01vs各自细胞对照组；d P＜0.01vs各自24h浓度组

川芎嗪（mg／L）24h A值 IR（%）48h A值 IR（%）72h A值 IR（%）对照组0.749±0.030 0.737±0.030 0.739±0.018 100 0.669±0.020 10.57±3.97b0.652±0.016 11.42±3.60b0.624±0.035 15.30±4.85b 200 0.606±0.014 18.90±4.77b 0.567±0.017 22.94±3.63bd 0.516±0.017 29.96±2.25bd 400 0.541±0.017 27.63±4.60b 0.516±0.014 29.99±2.82bd 0.475±0.019 35.45±2.18bd 800 0.510±0.011 31.75±4.06b 0.456±0.019 38.07±1.89bd 0.371±0.022 49.59±3.26bd

2.2 不同浓度川芎嗪对HepG2细胞凋亡的影响 不同浓度川芎嗪作用于HepG2细胞24h、48h和72h后，细胞凋亡率显著高于对照组 （F＝462.438，561.124，889.562，均P＜0.01），川芎嗪呈时间剂量依赖性地促进HepG2细胞凋亡，同一浓度作用48h其细胞凋亡率显著高于24h，作用72h又显著高于48h（P＜0.01，表2，图1）。

表2 不同浓度川芎嗪对HepG2细胞凋亡的影响（%，±S，n＝5）

表2 不同浓度川芎嗪对HepG2细胞凋亡的影响（%，±S，n＝5）

注：b P＜0.01vs各自细胞对照组；d P＜0.01vs各自24h浓度组

川芎嗪（mg／L）24h 48h 72h对照组2.03±0.67 2.07±0.12 2.23±0.12 100 4.84±0.51b 5.28±0.72b 4.94±0.38b 200 6.52±0.48b 8.77±0.87bd 12.58±1.31bd 400 8.69±0.93b 14.95±0.94bd 22.36±1.73bd 800 12.18±1.11b 21.19±1.64bd 31.31±2.05bd

图1 Hoechst染色法检测48h后HepG2细胞凋亡 （×200）A：对照组；B：100mg／L川芎嗪组；C：800mg／L川芎嗪组

2.3 不同浓度川芎嗪对HepG2细胞突变型p53蛋白表达的影响 对照组突变型p53蛋白呈较高水平表达，不同浓度川芎嗪作用HepG2细胞48h后，突变型p53蛋白表达随川芎嗪浓度的增加而逐渐降低，与对照组比较均有统计学意义 （F＝64.065，P＜0.01，表3，图2）。

表3 不同浓度川芎嗪作用HepG2细胞48h后p53蛋白的表达

图2 免疫细胞化学二步法检测HepG2细胞突变型p53蛋白的表达 （SP×400）A：阴性对照组；B：对照组；C：100mg／L川芎嗪组；D：800mg／L川芎嗪组

3 讨论

p53基因与人类肿瘤密切相关，其不仅是最强的抑癌基因，也是人类恶性肿瘤最常见的突变基因。研究表明，多种恶性肿瘤包括肝癌、胃癌、胰腺癌等与p53关系密切［7－9］，一旦p53基因发生突变，其不仅丧失抑癌功能，反而具有了癌基因活性，能促使细胞恶性转化［5－6］。先前，我们曾研究发现丹参酮IIA可能通过抑制突变型p53的表达而增强5－氟尿嘧啶对胃癌细胞抑制、凋亡作用［9］。因此，寻找以突变型p53为靶点的抗肿瘤药物成为目前研究的热点。川芎嗪是从中药川芎中提取的生物碱，它具有多种生物学活性，近年来研究发现其具有抗肿瘤和逆转肿瘤多药耐药的作用［3－4］。川芎嗪能诱导肝癌、肺癌、乳腺癌等一些肿瘤细胞发生凋亡［3，4，10］，但其对肿瘤细胞作用的相关机制报道不多。

本研究应用不同浓度的川芎嗪作用于p53突变型人肝癌HepG2细胞，结果发现，与对照组相比，川芎嗪能抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，上述效应随川芎嗪浓度的升高和作用时间的延长而增强，800 mg／L川芎嗪作用HepG2细胞72h后其抑制率达49.59%。我们进一步应用Hoechst染色法观察了不同浓度的川芎嗪对HepG2细胞凋亡的影响，结果发现，随着川芎嗪浓度的升高和作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增高，培养72h后其凋亡率高达31.31%。上述结果说明，川芎嗪可以通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡来发挥对HepG2细胞的杀伤作用。我们进一步用免疫细胞化学方法观察了不同浓度的川芎嗪对HepG2细胞突变型p53表达的变化，结果发现随川芎嗪浓度的升高和作用时间的延长突变型p53的表达显著降低，说明川芎嗪的凋亡增强作用与抑制突变型p53的表达有关。最近，韩娇艳等研究发现川芎嗪可以通过Akt信号通路影响前列腺癌PC3细胞的增殖和凋亡［4］。结合我们的研究结果，初步说明川芎嗪能抑制HepG2细胞株的增殖及诱导凋亡细胞作用，其机制可能与其抑制突变型p53的表达有关。

我们的研究结果提示，川芎嗪可能通过抑制突变型p53的表达诱导细胞凋亡来发挥对HepG2细胞的杀伤作用，为其合理的运用于临床提供理论思路。预示着川芎嗪在肝癌的治疗上有着广泛的前景，其具体的作用机制有待进一步研究。

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