金线莲组织培荞的条件优化研究

王建明，王松良，詹巧杰，古力，康智明，张金荣，林长芹

(1.福建农林大学作物科学学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学中药材GAP研究所，福建 福州 350002)

金线莲组织培荞的条件优化研究

王建明1，2，王松良1*，詹巧杰1，古力2，康智明1，张金荣1，林长芹1

(1.福建农林大学作物科学学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学中药材GAP研究所，福建 福州 350002)

本研究通过设置试验优化金线莲组培的条件，试验结果表明，金线莲外植体消毒处理以75％乙醇＋0.1％HgCl浸泡处理8min效果较好；增殖继代培养基以MS为基本培养基添加激素6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1的处理效果最优；培养基中添加20％香蕉对于芽苗的增殖及壮苗的培养均有极大的促进作用；液态培养基显著优于半液态和固态培养基；原球茎增殖途径增殖倍数高且增殖速度快，但培养出来的芽苗质量较弱小。

金线莲；组织培养；激素；有机添加物

金线莲(Anoectochilus roxborghii(wall.)lind.)为兰科开唇兰属多年生草本，又名金丝线、金耳环、乌人参等是我国传统珍贵药材，素有“金草”、“神药”等美称[1]。金线莲性喜阴凉、潮湿，尤其喜欢生长在有常绿阔叶树木的沟边、石壁、土质松散的潮湿地带，一般分布在海拔300～1 200m的丘陵地。我国福建、广东、广西、台湾、四川、贵州、云南均有野生金线莲。金线莲的药用价值非常之广。它具有清热凉血、袪风利湿、强心利尿、固肾、平肝等功能。常用于治疗咯血、支气管炎、肾炎、肺炎、糖尿病、风湿病、毒蛇咬伤、急慢性肝炎等症；近年来，还被用于治疗高血压、肿瘤、心脏病、化脓性骨髓炎、口疮、性病等[2-4]。金线莲除药用外，还是一种极具观赏价值的室内观叶珍品[5]。

金线莲种子微小，自然萌发率和繁殖率极低。早期市场上货源主要来自于野生采挖，极其稀少。近年随着对其药效和临床应用研究的深入，及其营养成分不断被发现，其药用价值及观赏价值，得到社会上更多人的关注，市场对于金线莲的需求急剧上升，其市场价格也不断被推高。金线莲对生态环境要求严格，其自身生长缓慢，产量极低，加之近年自然环境遭受严重破坏，野生金线莲无法满足市场需求。经过科研人员多年的研究，金线莲组织培养技术取得较大的进展，目前已实现较大规模工厂化育苗和人工栽培。由于金线莲生长缓慢，人工育苗的质量参差不齐，繁殖率低，生产成本高居不下，培养条件有待改进。本研究旨在探索金线莲组织培养条件的优化，以提高芽苗增殖率及生长速度及质量，为生产者改进技术措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采摘自福建三明的福建野生金线莲、台湾金线莲组培无菌苗(福建农林大学金线莲研究小组提供)。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 选取植株完整，生长粗壮，形态特征优良的野生金线莲植株，先用大量的清水冲洗去表面附着的泥土腐叶等杂物，去除根、叶(保留顶部叶片)备用。

将预处理好的野生金线莲茎先用无菌水冲洗3次，再进行消毒处理。设置11种处理方法为：(1)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(10min浸泡)；(2)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(20min浸泡)；(3)75％乙醇(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(5min浸泡)；(4)75％乙醇(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)；(5)75％乙醇(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(11min浸泡)；(6)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(10min浸泡)＋0.1％HgCl(5min浸泡)；(7)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(10min浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)；(8)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(10min浸泡)＋0.1％HgCl(11min浸泡)；(9)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(20min浸泡)＋0.1％HgCl(5min浸泡)；(10)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(20min浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)；(11)75％乙醇(30 s浸泡)＋2.0％次氯酸钠(20min浸泡)＋0.1％HgCl(11min浸泡)。浸泡消毒过程中轻微振荡，以提高消毒效果，浸泡处理后，用无菌水洗4次。

按小组分别将消毒处理后的材料切割成带一个节的茎段(长约1.5cm)和顶芽带叶(长约1.5cm)的外植体，分别接入诱导培养基，每瓶接一个外植体。

诱导培养基采用MS基本培养基，每个消毒处理接种30瓶，共330瓶。放入培养箱进行黑暗培养，培养温度为25℃。期间定期进行观察，排查污染瓶，培养30d后统计结果。

1.2.2 继代增殖培养基 选择MS、1/2MS和N6为3种培养基为A因素，以6-BA＋NAA3种水平组合为B因素设置两因素随机区组设计试验(表1)。每升培养基添加琼脂8g、蔗糖30g，pH调至5.6～5.8。接种的金线莲无菌苗材料，全都选取生长状况相近的茎段。接种后统一放在同一培养箱里培养，设置温度25℃，光照度1500-2000LX，光照时间12h·d-1。培养时间为60d后进行比较分析。

表1 金线莲增殖培养基试验因素与水平

1.2.3 有机添加物 以 MS＋8g·L-1琼脂＋30g·L-1蔗糖＋6-BA2mg·L-1＋NAA0.5mg·L-1为基本培养基，选择组培中常用的有机添加物：香蕉泥、椰子汗、马铃薯汁、蛋白胨(配合添加活性碳)等作为添加物，分别设置两个水平，比较各有机添加物的效果。

具体方法：香蕉去皮后称取所需质量加适量水用家用搅拌机打成香蕉浆，和煮化的琼脂、蔗糖共同加热后加入配制好的基本培养基，定容分装后高压灭菌；椰子汁以新鲜的椰子取汁，使用经过高温高压灭菌的溶剂过滤器和经过75％酒精消毒的超滤膜真空抽滤除菌，用灭过菌的量筒量取所需量加入己灭菌冷却但尚未凝固的培养基中并摇匀，最后分装到经过高压灭菌的组培瓶中冷却凝固；马铃薯汁选用质量良好的新鲜马铃薯块茎去皮后称取所需质量，切片后加适量水煮熟，用粗纱布过滤，薯汁加入培养基定容分装后高压灭菌；蛋白胨添加以称取所需质量，和琼脂、蔗糖共煮后加入基本培养基，分装灭菌后待用。

接种材料为无菌丛生苗，每个处理接种30瓶。培养环境：温度25℃，光照2000-3000LX，光照时间 12h·d-1。培养时间 60d。

1.2.4 琼脂添加量 以MS＋6-BA2mg·L-1＋NAA0.5mg·L-1＋30g·L-1蔗糖为基本培养基，以琼脂添加量为处理，设置3个水平8g、4g、0g，考察固态、半液态和液态培养基对丛芽培殖的影响。接种材料为无菌丛生苗。培养环境：温度25℃，光照2000-3000LX，光照时间12h·d-1。培养时间60d。

1.2.5 原球茎和丛生芽增殖比较 金线莲组培苗的增殖方式通常有圆球茎增殖和丛生芽增殖两种途径，本实验对两种途径的增殖效果及芽苗质量进行比较。

以 MS＋6-BA2mg·L-1＋NAA0.5mg·L-1＋30g·L-1蔗糖为基本培养基(不添加琼脂，液态)，分别以圆球茎和无菌丛生芽为接种材料。培养环境：温度25℃，光照2000-3000LX，光照时间12h·d-1。培养时间30d。

2 结果与分析

2.1 几种消毒处理效果比较

外植体消毒处理后，经过1个月时间培养，其中部分出现污染，未污染的外植体有一部分萌发出新芽，形成无菌苗；还有一部分未出现污染，但也不萌发，这部分材料呈永久休眠状态。具体情况见表2。

表2 金线莲外植体消毒处理效果情况统计/瓶

试验可知，第(4)组75％酒精(30 s浸泡)＋0.1％HgCl(8min浸泡)的萌发率最高，达到50％，优于其它参试组。外植体消毒不彻底易产生污染，消毒处理时间过长可使金线莲外植体因其毒害使幼芽出现死亡或进入永久休眠状态。0.1％HgCl与2.0％次氯酸钠配合消毒也可提升消毒效果，减少污染瓶数，但由于较长时间的浸泡处理，易引起对外植体的毒害作用，最终结果并不理想。

2.2 继代增殖培养基及激素的影响

不同基本培养基及激素组合，培养90d，每个组合随机抽取10瓶，分别计算其增殖倍数，对结果进行方差分析(见表3)。

表3 金线莲继代增殖试验结果的多重比较(增殖倍数)

由表3可见，MS基本培养基增殖倍数显著优于1/2MS和N6培养基，说明MS较适合作为金线莲组培的基本培养基；激素组合以6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1较好，增殖倍数最高。其中以 MS为基本培养基添加激素 6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1的处理培殖倍数最高，达到6.6倍，极显著优于其他处理(见表4)。

2.3 有机添加物的效果比较

增殖培养基添加不同有机物质，培养90d，每个组合随机抽取10瓶，分别计算其增殖倍数及观察瓶苗生长，对结果进行方差分析(见表5、表6)。

表5 有机添加物培养瓶苗增殖倍数差异比较

由表5可见，培养基中添加香蕉泥、椰子汁能提高增殖倍数，且均达到显著水平，其中添加香蕉泥的培养基其增殖倍数达到极显著水平。

由表6可以看出，培养基中添加香蕉泥、蛋白胨，其瓶苗明显比其他处理更为粗壮，且根系发达。其中添加香蕉泥的处理，其增殖倍数高，而且瓶苗粗状，是各处理中综合表现最优秀的培养基。

2.4 琼脂添加量对丛生芽增殖的影响

由表7可见，减少琼脂添加量，使培养基呈液态或半液态，均有利于瓶苗的增殖及生长，其中液体培养基增殖倍数最高。液态培养基适宜用于丛芽或原球茎的增殖培养，接入的种芽或原球茎不能被液体培养基淹没，因此，对于个体较小的丛芽或原球茎要求液体培养基装瓶量较浅。

表6 有机添加物培养瓶苗生长状况比较

表7 琼脂添加量对丛生芽增殖的影响

2.5 原球茎和丛生芽增殖效果比较

由表8可见，原球茎增殖扩繁倍数远高于丛生芽的增殖倍数，但原球茎增殖产生的芽苗较为弱小，要形成壮苗，还要经过一代促壮培养才能获得优质种苗。

表8 原球茎和丛生芽增殖效果比较

3 小结与讨论

3.1 外植体消毒处理对金线莲培养的影响

获得无菌系是组培工作的基础，野生金线莲生长在阴暗潮湿的自然环境中，除了繁多的伴生真菌与细菌外，还有大量的内生菌，这些微生物不易清除，给金线莲的组培工作带来极大的困难；金线莲肉质茎脆弱，化学清毒过程对金线莲外植体存在较大的伤害，处理时间过长，易造成外植体死亡或诱发其永久休眠，而处理时间不够则不易彻底消除微生物，从而影响无菌系的获得[7]。本研究中，采用75％乙醇浸泡30 s结合1％HgCl浸泡8min，获得较好的消毒效果。

3.2 继代增殖培养基对金线莲培养的影响

不同的基本培养基和激素浓度水平对金线莲的继代增殖培养存在显著的影响，本研究中MS培养基的培养效果显著优于1/2MS和N6培养基。添加激素能显著促进芽苗的增殖与生长，以MS为基本培养基添加激素6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1的处理效果最优，能获得较高的增殖倍数，且培养的芽苗较为粗壮，同时诱导芽苗生根，可实现增殖和生根一步完成(因此本研究中不再进行根系诱导的试验)。

3.3 有机添加物对金线莲培养的影响

不同有机添加物对金线莲组培苗生长效果存在显著的差异。试验结果表明，培养基中添加香蕉对于金线莲芽苗的增殖及壮苗的培养均有极大的促进作用。同时添加激素和香蕉的培养基增殖倍数高于不添加激素的香蕉培养基，但不添加激素的香蕉培养基获得的组培苗更为粗壮，对于由原球茎诱导分化出来的较细弱而又数量繁多的丛芽的促壮培养，使用不添加激素的香蕉培养基效果更佳。

椰子汁也是金线莲组培中常用的有机添加物，对芽苗的增殖有较好的效果。但添加椰子汁的培养基对于培育壮苗效果较差，而且配制椰子汁培养基程序复杂，操作过程极易造成培养基的批量污染。

添加蛋白胨的处理虽然增殖倍数不理想，甚至低于对照，但其瓶苗生长粗壮，能够获得特别粗壮的单株带根无菌苗，为后继移到瓶外栽培提供理想的壮苗，因此也是一种较为理想的培养基添加物。

3.4 琼脂添加量对丛生芽增殖的影响

琼脂添加量主要影响培养基的硬度及形态，目前很少人研究其对金线莲组培的影响。常用的培养基琼脂添加量为8g，培养基为固态；琼脂添加量减少至4g时，培养基呈半液态；不添加琼脂的培养基则为液态。本实验结果表明，对于丛生芽或原球茎的增殖培养，液态培养基优于半液态和固态的培养基，其原因可能是液态或半液态培养基与芽苗接触面大，且营养物质和激素易于流动而利于芽苗吸收利用。

3.5 原球茎和丛生芽增殖培养差异

原球茎增殖和丛生芽增殖是金线莲组培的两种增殖途径，原球茎增殖倍数远高于丛生芽的增殖倍数。原球茎自身增殖速度较快，又能在较短的时间内分化成数量繁多的幼苗，这对于工厂化育苗有较大的实用意义。原球茎增殖途径能够在较短的时间内获得大量的无菌苗，但这些苗通常较为细弱，要培养成为适合移栽的壮苗还要经过促壮促根培养。

[1]许文江，陈裕.药用野生金线莲植物资源的研究[J].福建热作科技，2000，25(4)：9-10.

[2]孔祥海.“药王”金线莲的自然资源初步研究[J].中草药 .2001，32(2)：155-157.

[3]马志杰，胡宏友.民间药材金线莲研究动态(综述)[J].亚热带植物科学 .2002，31(B09)：27-31.

[4]钟岑生.金线莲的药用价值与开发[J].广西农业科学，1997，(2)：102-104.

[5]陈汉鑫，王雅英，杨忠耿，等 .金线莲组织培养快繁技术 [J].广西农业科学，2004，35(4)：325-326.

关于召开“中药材GAP发展论坛”暨中国药材GAP研究促进会(GAPA)第三次理事会的通知(第一轮)

1998年11月，国家药品监督管理局邀请国家科委、经贸委、中医药局等同志及专家共同商讨并提出在我国推行〈中药材生产质量管理规范(GAP)》的命题，随即成立GAP起草专家组，2002年3月国家食品药品监督管理局通过了《中药材生产质量管理规范(GAP)》(试行)，并于同年6月1日发布实施。

迄今，我国实施GAP已走过10年风雨征途，中国药材GAP研究促进会(GAPA)成立12周年，为了回顾和总结10年来中药材GAP实施成果，展示中华医药文化的丰富内涵，汲取有用的经验和教训，更加信心百倍地为中药标准化、现代化和国际化而继续奋斗，为中国和世界人民的健康事业作出更大的贡献，中国药材GAP研究促进会拟于2013年第三季度召开中药材GAP发展论坛暨GAPA第三次理事会扩大会议，请GAP专家组成员，GAP文本起草小组成员，GAPA理事及会员届时出席会议，并热烈欢迎广大医药工作者，有关中药农业、中药工业、中药医疗，中药资源教育及临床等中医药业各界人士参与研讨，共谋发展。

会议筹备联系人：

夏少杰：025-86612510 13151070912 E-mail：cpuxsj＠163.com

金久宁：025-84347019 13915940171 E-mail：jinjn＠mail.cnbg.net

地 址：南京市中山门外南京中山植物园

邮 编：210014

Study on Condition Optim ization of Tissue Culture for Golden Thread Lotus(GTL)

WANG Jian-ming1，2，WANG Song-liang1，ZHAN Qiao-jie1，GU Li2，KANG Zhi-ming1，ZHANG Jin-rong1，LIN Chang-qin1
(1.College of Crop Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2.Institute of GAP for Chinese Medicinal Materials，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China)

This study focused on optimizing tissue culture medium conditions for Golden Thread Lotus.The results showed that：(1)it is better to process the explants of Golden thread lotus by dealing with 75％ethanol for30 sec and then soaking in 0.1％HgCl for 8 minutes than other treatments；(2)it is the bestmedium to be cultured on MS＋6-BA/2mg·L-1＋NAA/0.5mg·L-1for the proliferation of Golden thread lotus；(3)the MSmedium with 20％banana contributed to the proliferation of bud seeding and strong seedling；(4)the effect of liquid medium was better than semi-liquid and solid medium for culture；(5)it is better both in multiples and speed through protocorm proliferation pathway than other pathways，but the bud seeding obtained wasweak.

Golden thread lotus(GTL)；Tissue culture；Hormone；organic additive

2012-09-18)

*[通讯作者]王松良，wsoloedu07＠126.com