秋水仙素对泽林考兰原球茎生长及分化的影响

邓小果李贵雨

(1.海南开放大学农林医药科技学院，海南 海口 570208;2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 海口 571101)

泽林考兰(Zelenkoa onusta(Lindl.)M.W.Chase & N.H.Williams)隶属文心兰亚族的单种属，主要分布在厄瓜多尔和秘鲁，附生于海拔0～1200m干旱森林的岩石或树干上，耐高温和干旱能力较强。泽林考兰具有花期长，花序可达60cm，花色鲜黄色等性状，观赏价值高。到目前为止，国内对泽林考兰的研究较少，仅有少数的植物园引种和小规模的杂交育种工作。在国际兰花登录机构——英国皇家园艺协会(RHS)登录的以泽林考兰为亲本的杂交种有15属66个组合，可以与文心兰亚族成员广泛杂交，显示泽林考兰较强杂交亲和力。

通过化学诱变育种技术与植物组织技术相结合，具有不受环境条件限制、节省大量人工和时间、扩大变异谱和提高变异率等优点[1,2]，在作物遗传改良方面具有独特发展优势和潜力。秋水仙素诱变多倍体应用于多种兰科植物，已在文心兰[3-6]、蝴蝶兰[7,8]、石斛兰[9]、墨兰[10]等有相关研究，这些研究可为兰科植物多倍体育种提供试验依据。本试验利用已建立的泽林考兰的离体培养再生体系，以泽林考兰原球茎为材料，研究秋水仙素处理对其原球茎生长及分化的影响，为泽林考兰多倍体育种技术提供理论试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为健壮泽林考兰原球茎，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素处理

选取生长旺盛，大小基本均匀的泽林考兰原球茎，在超净工作台上用镊子将其单个剥离，浸入不同浓度的秋水仙素溶液中。秋水仙素的浓度分别为600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1。处理时间为12h、24h、48h，处理后用无菌水冲液冲洗3次；以不加入秋水仙素的无菌水作为对照。

1.2.2 处理材料的培养和观察

将处理后的原球茎接到继代培养基(1/2MS加6-BA 2.5mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加蔗糖30g·L-1加卡拉胶7.5g·L-1)中，每个处理接种40个原球茎，每个处理重复3次，所有材料均在同一条件下培养。培养温度26±1℃，每天光照12h，30d后统计死亡率和膨大率。培养过程中观察原球茎的生长情况。

死亡率(%)=死亡原球茎数/接种原球茎数×100%

膨大率(%)=膨大原球茎数/接种原球茎数×100%

1.2.3 原球茎分化

将继代后的原球茎继续转入分化培养基(1/2MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 0.15mg·L-1加蔗糖30g·L-1加卡拉胶7.5g·L-1)中，接种时已褐变死亡的原球茎不再转接。培养温度26±1℃，每天光照12h，30d后观察生长情况并统计分化率。

分化率(%)=分化成芽原球茎数/接种原球茎数×100%

2 结果与分析

2.1 秋水仙素处理对原球茎生长的影响

将处理后的原球茎接到继代培基中培养观察，30d后统计其死亡率和膨大率，见表1。随着秋水仙素浓度的增加及处理时间的延长，部分类原球茎膨大，同时部分原球茎受伤害程度也越明显，甚至褐化死亡。由表1可知，对照原球茎的死亡率最低，原球茎膨大率为0；秋水仙素处理后原球茎的死亡率均大于30%，死亡率都高于对照，这表明秋水仙素对原球茎生长有抑制作用。处理时间相同时，秋水仙素浓度越高，死亡率越高；处理浓度相同时，处理时间越长，死亡率越高。当处理时间为12h和24h时，随着处理时间的延长，原球茎膨大率增加，当处理时间为48h时，原球茎膨大率下降，高浓度原球茎长势弱，没有出现原球茎膨大，在后期培养中，慢慢死亡。总体上看，在浓度为1000mg·L-1，处理时间为24h，原球茎的死亡率为51.67%，原球茎膨大率较高，膨大率为21%，长势良好。

表1 秋水仙素处理对泽林考兰原球茎生长的影响

2.2 秋水仙素处理对原球茎分化的影响

将继代培养后存活的原球茎转接到分化培养基中，经过秋水仙素处理后的类原球茎出芽时间比对照晚，小芽生长迟缓，出现肉质芽，随着秋水仙素处理浓度时间增大，小芽生长受抑制越明显，且在生长过程中部分芽逐渐黄化死亡。

从表2可知，处理时间为12h的原球茎分化率均在70%以上，随着秋水仙素浓度的升高成活率逐渐降低；处理时间为24h的原球茎分化率有所下降，且随着秋水仙素浓度的升高成活率逐渐降低，处理时间为48h时，仅有浓度为600mg·L-1时分化出苗，且分化率仅为24%。试验表明，秋水仙素处理时间对原球茎的分化影响较大。当处理时间为24h，浓度为1000mg·L-1时，分化率为54%，接近对照组的58%，且出现幼叶变宽变厚。

表2 秋水仙素处理对泽林考兰原球茎分化的影响

3 讨论

多倍体育种是兰科育种重要方法之一，外植体类型及处理方法都对多倍体的诱导效果有较大影响。植物组织分裂旺盛的时期和部位如类原球茎等是多倍体诱导中常用的材料。崔广荣等用秋水仙素处理原球茎离体薄切片，再生后的植株都有表现为粗壮、矮化、叶片增宽增厚和叶片线艺等变异[3,4]。用125mg·L-1秋水仙素对朵丽兰(Dortis pulcherrima)的原球茎进行处理7d，发现原球茎再生率为42%～59%，再生植株中46%为四倍体[11]。采用紫外线照射和秋水仙素处理对春兰(C.goeringii.)原球茎进行处理，再生植株出现变矮、叶片增宽增厚、叶片出现艺兰等变异性状[12]。张志胜等用秋水仙素处理墨兰(C.sinense)和大花蕙兰(C.hyridus)的杂交Fl种子诱导的原球茎，经秋水仙素处理后原球茎的生长和分化起抑制作用，且随着处理浓度增高抑制作用越强，秋水仙素处理原球茎后的再生植株出现了植株粗壮、多叶、叶片变宽、变厚、叶片墨绿色、矮化、线艺和叶艺等变异类型，变异率为9.06%，其中秋水仙素浓度为0.10%、处理时间为48h时，植株变异率最高[6]。吴彦秋等用秋水仙素处理杜鹃兰原球茎，试验表明，随秋水仙素浓度及处理时间的增加，原球茎的存活率降低，小苗呈现植株粗壮、叶片质地较硬、假鳞茎变大、根粗短且数量少等性状，不同浓度及处理时间对多倍体诱导率不同，最高诱导率20%[13]。

本研究用不同浓度的秋水仙素溶液处理泽林考兰原球茎后，原球茎生长和分化都受到不同程度的影响。秋水仙素处理后的原球茎均出现死亡和膨大，随着浓度增大和处理时间延长，死亡率增大，在分化培养中，随着处理浓度和处理时间的增加，分化率逐渐下降，小芽生长迟缓，出现肉质芽。当浓度为1000mg·L-1，处理时间为24h，原球茎的膨大率为21%，死亡率为51.67%，可作为泽林考兰多倍体诱导参考浓度。