丙肝核心抗原－CD40L胞外段真核表达载体的构建及其免疫原性分析

陈佳玉，戚永孝，陈 洁，金晓燕，张丽荣

（1.台州学院医学院，浙江 台州318000；2.台州市立医院，浙江 台州318000；3.长春市中日联谊医院，长春130033）

丙肝病毒感染严重威胁人类健康，疫苗可能是治疗该感染的有效方法之一。目前，丙肝治疗性疫苗的研究多是在丙肝结构蛋白基础上进行改造，融合适当的免疫调节因子是提高蛋白免疫原性的有效方法之一。CD40L胞外段能与树突状细胞表面CD40分子结合，促进树突状细胞成熟，促进特异性免疫反应，与HCV core融合后有望提高其免疫原性。本实验在原有质粒的基础上，构建了带有HCV core和CD40L胞外段融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1－core－CD40L，并探讨了其免疫原性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

带有丙肝核心抗原的真核表达质粒pcDNA3.1－HCV core及带有人CD40L胞外段基因序列（GeneralBank编号NM＿000074）的真核表达质粒pcDNA3.1CD40L均为本室保存。内切酶和连接酶均购自于TaKaRa，CD4和CD8荧光标记抗体为BD公司的产品。5周龄雄性ICR小鼠来源于浙江省实验动物中心。丙肝病毒抗体ELISA检测试剂盒购自于健仑。所得实验数据经SPSS17.0软件进行统计学分析，组间差异性进行t检验。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒构建

利用基因重组技术在原有质粒pcDNA3.1－HCV core和pcDNA3.1－CD40L的基础上构建真核表达质粒pcDNA3.1－core－CD40L，并经酶切鉴定。质粒构建流程如图1。

图1 质粒pcDNA3.1－core－CD40L构建流程图

1.2.2 免疫原性检测

超纯质粒大提试剂盒提取质粒，100μg/只大腿肌肉内注射免疫5周龄雄性ICR小鼠，每周免疫一次，共两次，二次免疫后七天杀鼠取外周血和脾，分离血清及淋巴细胞（密度梯度离心）。ELISA检测试剂盒检测血清中抗丙肝核心抗体；取外周血单个核细胞，荧光标记的抗CD4、CD8抗体染色后，利用流式细胞仪检测T细胞亚型；取所得脾淋巴细胞，利用T细胞富集柱分离T细胞，经PE标记的CD3抗体进行标记后，通过流式细胞仪检测T细胞纯度；并用佛波醇酯（Phorbol－12－myristate13－acetate，PMA）和离子霉素（Ionomycin，Ion）刺激 T细胞，6小时后用Real time PCR法检测T细胞内IL－2 mRNA、IFN－γmRNA 及 IL－4mRNA 的 水 平。PCR引物序列如表1。同时以本实验室制备的HCV体外感染细胞模型为靶细胞，以上述脾淋巴细胞为效应细胞，效靶比5∶1来进行细胞杀伤实验，并通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

表1 细胞因子PCR引物序列

2 结果

2.1 HCV核心抗体效价的检测

免疫后小鼠外周血经ELISA检测试剂盒检测，结果显示，质粒pcDNA3.1－core－CD40L免疫小鼠，可诱使小鼠产生高滴度的抗丙肝核心抗原抗体（4266±328），P＜0.01。

2.2 外周血淋巴细胞亚型的检测

流式细胞仪检测结果显示：质粒pcDNA3.1－core－CD40L免疫组小鼠外周血中CD4＋和CD8＋细胞比例明显增加，且以CD8＋细胞增高更为显著，P＜0.01。如表2。

表2 小鼠外周血T淋巴细胞亚型流式细胞仪检测结果

2.3 T细胞内细胞因子检测

Real time PCR检测结果显示：pcDNA3.1－core－CD40L免疫组小鼠T细胞内细胞Th1型和Th2型细胞因子分泌均明显高于对于照组，P＜0.01。同时Th1型细胞因子分泌水平的增高明显高于 Th2 型。检 测结果提示，pcDNA3.1－core－CD40L免疫组更易诱发T0细胞向Th1型细胞转换。如表3。

表3 T细胞内细胞因子Real time PCR检测结果

2.4 CTL杀伤活性检测

以感染有HCV的Hela细胞为靶细胞，按效靶比5∶1加入效应细胞，37℃5%CO2条件下孵育18－24h。经清洗后，流式细胞仪检测细胞凋亡结果如图2。结果显示：pcDNA3.1－core－CD40L组细胞凋亡比例（54.1%）明显高于对照组（30.9%），即诱发了较强的CTL杀伤活性，P＜0.01。

图2 CTL杀伤活性检测结果

3 讨论

HCV感染目前在世界范围内流行广泛且已严重影响着人类的健康，虽然众多科学工作者对HCV感染的防治作了多次尝试，但目前尚无很好的办法将其彻底治愈［1，2］。为了制备有效的丙肝治疗性疫苗，本实验选取基因比较稳定的HCV核心区基因［3］，并将此基因与CD40基因的胞外段进行重组，构建成真核表达载体。CD40L是一个Ⅱ型跨膜糖蛋白，为TNF超家族成员之一，它是参与机体特异性细胞免疫和体液免疫的重要免疫共刺激分子，能与表达于树突细胞表面的CD40分子作用，调节免疫反应。经CD40L刺激后的DC具有如下特性：①抗原递呈能力增强；②具有较强的T淋巴细胞趋化能力；③体外刺激T淋巴细胞增殖反应能力增强；④表面CD80、CD86等共刺激分子明显上调，并能够产生大量的IFN－γ、IL－12、TNF－α等细胞因子，促进T细胞由Th0向Th1转化［4］。因此，本实验小组以基因重组的方式构建了真核表达载体pcDNA3.1－core－CD40L，并对其免疫原性进行了检测。结果揭示，该疫苗肌肉内注射免疫小鼠，能诱发其产生抗HCV核心抗原的高水平抗体。T细胞亚型流式细胞仪检测结果及T细胞内细胞因子Realtime PCR检测结果证实该疫苗能诱使T0细胞向Th1细胞转换。特异性CTL杀伤实验结果提示该疫苗能够诱发小鼠产生强的细胞免疫反应，可能对HCV感染一定的防治作用。

［1］Cohen J.The scientific challenge of hepatitis C［J］.Science，1999，285：26.

［2］Popescu C，Gliga S and Arama V.Trends in hepatitis C virus infection therapy：protease inhibitors a step forward in the era of direct acting antivirals［J］.Rom J Intern Med，2013，50（2）：117.

［3］Dawson GJ.The potential role of HCV core antigen testing in diagnosing HCV infection［J］.Antivir Ther，2012，17（7Pt B）：1431.

［4］林贤凡，吴金明，陈 瑾，等.乙肝表面抗原－CD40L胞外段融合蛋白的设计和生物活性预测［J］.温州医学院学报，2009，3：205.