热休克处理的肿瘤细胞培养上清对脐血淋巴细胞活性的影响

任林广，赵珍谊，张 健，徐广伟，段北野

（1.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012；2.长春百克生物科技股份公司，吉林 长春130012）

肿瘤微环境 （tumor microenvironment）是肿瘤所处的内环境，由肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质、微血管、组织液等与肿瘤细胞本身共同构成［1，2］。不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，也与肿瘤细胞自身内环境有关。肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。近年来由于肿瘤细胞学和分子生物学的进展，人们对于肿瘤和环境的相互关系有深入了解，认识肿瘤的发生、发展、转移等有着重要的意义。本研究通过观察热休克处理的SMMC－7721细胞培养上清对脐血淋巴细胞表型及杀伤活性的影响，进一步探讨肿瘤微环境中某些成分的改变与肿瘤局部浸润的淋巴细胞之间的关系及其对肿瘤生长的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人脐带血采自长春市妇产医院，K562人红白血病细胞株和SMMC－7721人肝癌细胞株均由本所细胞室提供，人重组干扰素－γ（rIFN－γ）购自长春宝泰克生物科技公司，CFSE（C－1157）购自Molecular Probes公司，PI购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 热休克处理的SMMC－7721细胞上清制备收集处于指数生长期的SMMC－7721细胞，调整细胞密度为2×109/L，接种于培养皿中，6×106个细胞/皿，常规培养48h，更换无血清IMDM，然后将一组培养皿于37℃条件下培养，另一组于42.5℃条件下培养。24h后分别收获上清，离心（10 000 rpm，10min），分装，80℃保存备用。用分光光度计测定蛋白浓度。

1.2.2 脐血单个核细胞制备 将采集的脐血用生理盐水稀释，叠加到淋巴细胞分离液液面上，离心（2 000rpm，20min），吸取界面层细胞，生理盐水洗涤2次。用含10%FCS的IMDM培养液重悬细胞，调整细胞密度为3.5×106个/mL。

1.2.3 肿瘤培养上清及细胞因子诱导 将上述制备的脐血单个核细胞接种于6孔板中，3ml/孔，分6组。①IMDM（对照组）；②37℃培养上清 （SN1）；③42.5℃培养上清 （SN2）；④IFN－γ，；⑤SN1＋IFN－γ；⑥SN2＋IFN－γ，每组4复孔。SN1和SN2的终浓度为50μg/ml，IFN－γ终浓度为1 000μg/ml，对照组以等体积IMDM 代之。将培养板置37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养一周。

1.2.4 形态学观察 将培养板置于倒置显微镜下观察形态学变化并照相。

1.2.5 淋巴细胞亚群检测 采用流式细胞术，通过四色荧光标记，进行T淋巴细胞亚群的检测，采用CellQuestPro软件分析T淋巴细胞群体百分含量。实验步骤简述如下：加入荧光抗体CD45//483染液5μl于A管中，CD3/16＋56染液10μl于B管中，向各管内分别加入相对应的细胞样品，各100μl，充分混匀，20－25℃条件下避光标记15－20min。再向各管内分别加入生理盐水1ml，震荡混匀，避光保存。4h内上机检测。

1.2.6 NK活性检测 采用CFSE/PI双荧光染料标记的流式细胞计数法［3］。方法简述如下：

取处于指数生长期的K562细胞用含10%FCS的IMDM培养液重悬并调整细胞密度为5×105个/ml.加入 CFSE（使终浓度为2.5μmol/L），置37℃孵箱内标记8min。生理盐水洗涤3次，重悬于10ml含10%FCS的IMDM培养液中，细胞密度为6×104个/ml。将此CFSE标记的K562作为靶细胞加入U型底96孔板中，100μl/孔。收获前述不同条件诱导的脐血淋巴细胞，调整细胞密度为3×106个/ml作为效应细胞，加入U型底96孔板中，100μl/孔，效靶比50∶1。37℃培养4h。收取各组细胞于相应标号的试管中。取未标记的K562细胞、CFSE标记的K562细胞和对照组效应细胞各少许作为调试电压的对照。向所有各管中分别加入PI（100μg/ml）25μl。再向各管中补加生理盐水1 ml，混匀，冰水浴5min，流式细胞仪测样。收集1000个靶细胞，测量PI和CFSE双标记细胞的百分比。杀伤活性的计算公式为：

1.3 统计学方法 数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理。两样本均数比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞形态学变化 脐血淋巴细胞在不同培养基中生长一周后，光学显微镜下可见，形态有明显不同。在IMDM培养基中生长良好，可见少许细胞碎片；在含SN1的培养基中细胞生长状态欠佳，数量减少，碎片增多；当细胞在含SN2的培养基中生长时状态较好并且可见到很多小细胞。但是当在培养体系中单独加入IFN－γ后，细胞变大变圆，数量增加。而在IFN－γ培养体系中加入SN1后大圆细胞数量减少但加入SN2时大圆细胞数量又有所增加（图略）。

2.2 脐血淋巴细胞在不同培养环境中细胞表型及杀伤活性的变化

2.2.1 脐血淋巴细胞表型的变化 脐血淋巴细胞在不同培养环境中培养一周后细胞表型发生改变。表现在：SN1组 CD3＋、CD4＋、CD3－CD16＋CD56＋和CD3＋CD16＋CD56＋四个亚群的细胞百分数与对照组（IMDM）比较没有明显差别，CD8＋ 细胞百分数下降（P＜0.05）；SN2组表中五个亚群的细胞百分数与对照组比较均没有明显差别，但是CD8＋ 、CD3－CD16＋CD56＋细胞百分数与SN1组比较明显增加（P＜0.05）；IFNγ组CD3＋、CD4＋细胞百分数与对照组比较明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；而CD3－CD16＋CD56＋细胞百分数明显增加（P＜0.01）；IFNγ＋SN1组表中前4个亚群细胞百分数与IFNγ组比较均明显降低（P＜0.05），与对照组比较CD3＋、CD4＋ 、CD8＋细胞百分数也明显降低（P＜0.01），CD3－CD16＋CD56＋细胞百分数虽然高于对照但无统计学意义；IFNγ＋SN2组与对照组比较CD3＋、CD4＋和CD8＋细胞百分数均明显降低（P＜0.05，P＜0.01），CD3－CD16＋CD56＋细胞比例明显增高（P＜0.01），而与IFNγ组比较则只有CD4＋细胞百分数明显降低（P＜0.05）。与IFNγ＋SN1组比较各亚群均无统计学差异，但是，CD8＋ 和CD3－CD16＋CD56＋细胞比例有所增高。见表1。

表1 脐血淋巴细胞在不同培养环境中细胞表型的变化

2.2.2 脐血淋巴细胞在不同培养环境中细胞杀伤活性的变化 脐血淋巴细胞在不同培养环境中培养一周后，细胞杀伤活性发生明显改变且与细胞表型改变一致。SN1组NK活性与对照组（IMDM）比较明显降低（P＜0.05）；SN2组较SN1组活性增强，差异显著（（P＜0.05）；IFNγ组细胞杀伤活性比较对照组非常显著提高（P＜0.01）；IFNγ＋ SN1组较IFNγ组明显降低（P＜0.01）与对照组及SN1组相比无明显差异；IFNγ＋SN2组杀伤活性低于IFNγ组（P＜0.01），高于IFNγ＋ SN1组（P＜0.05），但与对照组和SN2组比较无明显差异。见表2。

表2 脐血淋巴细胞在不同培养环境中细胞杀伤活性的变化

3 讨论

应激反应能够启动热应激基因的表达，产生一组高度保守的热应激蛋白（heat shock proteins，HSPs），其中最主要的是HSP70。HSP70按表达情况又可分为结构型HSP70和诱导型HSP70，前者在应激情况下略增加。而后者仅出现于应激细胞，通常在正常细胞中并不表达或表达量很少。但是在应激原的作用下则表达迅速增加，并可释放到周围环境中。大量的实验研究已经充分证明了热应激处理能够诱导肿瘤细胞表面表达和释放 HSP70［4－7］，并且证实了细胞外HSP70能够激活T辅助细胞，增强淋巴细胞的细胞毒活性［8］。我们的实验结果表明，42.5℃热休克处理的SMMC－7721细胞培养上清（SN2）可以使脐血淋巴细胞亚群比例发生改变，表现在CD8＋ 、CD3－CD16＋CD56＋细胞百分数与37℃常规条件下的SMMC－7721培养上清（SN1）组比较明显增加（P＜0.05），同时，细胞杀伤活性也有改变，SN1组脐血淋巴细胞的杀伤活性较对照组明显下降（P＜0.05），而SN2组与对照组比较无明显差别（P＞0.05）但较SN1组明显增强（P＜0.05）。这一结果进一步证明了热应激处理后的肿瘤细胞培养上清较常规条件下的肿瘤细胞培养上清对脐血淋巴细胞的抑制作用大大减轻，这可能与热应激处理后的肿瘤细胞表达和释放HSP70有关。

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