HLA－B27基因亚型分型检测

黄宝英，杨 菁，富显果，曹罗元，唐宝佳

（福建医科大学附属宁德市医院 细胞分子生物学实验室，福建 宁德352100）

强直性脊柱炎（ankylosing spongdylitis，AS）是一种病因不明的骨－韧带结合部慢性炎性疾病，主要累及骶骼关节、脊柱、脊柱软织及四肢关节，多见于中青年男性，主要症状是腰、骶以及下肢关节疼痛，晚期患者脊柱僵直成板状，活动受限，基因遗传和免疫因素在其发病中发挥重要作用，患者体内存在复杂的免疫功能改变［1，2］。1973年Brewerton等人发现HLA－B27基因与强直性脊椎炎关系密切，该观点已经通过研究得到证实［3］。研究表明，AS患者中HLA－B27阳性率高达96%以上，而正常人群中仅为4%－7%［4］。因此，HLA－B27成为诊断强直性脊椎炎的有力工具。

HLA－B27的检测包括微量淋巴细胞毒性试验（CDC）、流式细胞术（FMC）、PCR分型检测等方法，CDC法操作复杂，FMC法虽然检测灵敏，但成本高，仪器昂贵，标本不易存放，而分型检测结果准确性高，操作简单，成本相对低，并且不需要活细胞，因此，分子分型检测 HLA－B27成为一种趋势［5］。

本实验采用HLA－B27SSP亚型分型试剂盒进行分型检测，其中含有1个HLA－B27抗原的决定引物和7个HLA－B27亚型抗原的引物，用以检测HLA－B27型别。

1 材料与方法

1.1 材料

全自动流式细胞仪（贝克曼、Epics XL）；凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司、GenoSENS1500）；电泳仪（北京市六一仪器有限公司、DYCP－32B）；PCR热循环仪（美国 Applied Biosystems公司、2720型）；生物安全柜（Heal Force，HFSafe 1200TE CB2型）。PCR试剂（10×Taq Buffer、dNTP、Taq酶）、TA克隆试剂盒、DNA分子量标准DL2000（大连宝生物公司产品），DNA提取试 剂 盒 （SE Blood DNA Kit D3471－01，OMEGA bio－tek），HLA－B27MorganTM SSP亚型分型试剂盒（美国TBG有限公司）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 标本采集

将50μL全血加入测定管中，加入10μl免疫荧光标记的单克隆抗体HLA－B27FITC/HLA－B7 PE，混匀，室温避光孵育20min；加入250μl Optilyse C溶血素，混匀，室温避光15min；加入500l鞘液，混匀，3 000r/min离心1min，弃上清液，重复该步骤，最后加入500μl鞘液重悬细胞，上机检测。

1.3 基因亚型分型

1.3.1 基因组DNA提取 使用OMEGA公司血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3.2 目的片段扩增 根据GeneBank中 HLAB27基因的cDNA序列，设计保守序列引物E91F：5’－GGGTCTCACACCCTCCAGAAT－3’、E136R：5’－CGGCGGTCCAGGAGCT－3’，以及一对内参引物 BGF：5’－CTCAGGAGTCAGATGCACCA－3’、BGR：5’－ACTCCTAAGCCAGTGCCAGA－3’。PCR反应体系如下：1μl10×Taq PCR Buffer，0.8 μl dNTP （2.5mmol/L），2μl E91F/E136R （10 μmol/L ），1μl BGF/BGR （10μmol/L ），2μl DNA，0.1μl Taq DNA Polymerase，置一 PCR 管中，混匀，按以下循环条件扩增：94℃5min，94℃1 min，62℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸7min。将10μl扩增产物加入10%琼脂糖凝胶，置于1×TAE缓冲液中电泳。

1.3.3 HLA－B27试剂盒检测 用 HLA－B27MorganTM SSP亚型分型试剂盒进行检测试验，样品A260/A280在1.65－1.8之间，样品的浓度在10－80 ng/μl。PCR反应体系如下：10μl Master Buffer，2 μl DNA，0.06μl Taq DNA Polymerase，置一 PCR管中，混匀，按以下循环条件扩增：96℃2.5min；96℃15s，65℃1min，10个循环；95℃15s，62℃50s，72℃30s，22个循环，将8μl扩增产物加入10%琼脂糖凝胶，置于1×TAE缓冲液中电泳。

2 结果

2.1 流式细胞仪筛选阳性样本

通过流式细胞仪对收集的样本进行检测，当HLA－B27MFI超过8，HLA－B27＋和 HLA－B7一细胞百分比超过90%时，可以判断样本为阳性［5］，结果如下（图1）。共选取259个流式细胞仪检测的样本，其中阳性样本232例，男性163例，女性69例，阴性样本27例。

图1 流式细胞仪检测结果

2.2 HLA－B27PCR－SSP法检测

通过PCR扩增HLA－B27目的片段，结果有4个PCR结果与流式细胞仪的检测结果不同，目的基因片段在135bp处，内参条带大小为250bp左右（图2）。

2.3 PCR－SSP检测基因亚型

图2 HLA－B27目的片段扩增结果

随机选取91个PCR阳性样本，以及4个与流式细胞仪检测结果不符的样本，用分型检测试剂盒进行试验，结果4个样本结果为阴性，与PCR结果相符。PCR阳性样本中2例表现为HLA－B27阳性（图3A），但无型别，占2.20%；88例表现为B2704/25（图3B），占96.7%；1例表现为B2705（图3C），占1.10%。另取2个流式细胞仪检测与PCR扩增均为阴性的样本作为对照，检测结果为阴性（图3D）。

图3 HLA－B27分型检测

3 讨论

强直性脊柱炎是一种病因不明的自身免疫性疾病，患者有明显的家族遗传性，男性患者明显多于女性，且临床表现较女性严重［2］，本实验收集了232例强直性脊柱炎患者样本，其中163例为男性，69例为女性，直接证明了强直性脊柱炎发生存在明显的性别差异。

在本研究中发现，用PCR检测B27基因比流式细胞仪检测的准确性更高，但是费时也比较长，因此，在临床上可以用PCR作为辅助手段，进一步判断弱阳性的样本，提高准确性。

人类白细胞抗原HLA是已知的人类等位基因多态性最高的遗传系统，共有44个基因，HLA－B27是其B位点上的第27个等位基因。HLA－B27目前已经发现有99个亚型，命名依次从B2701－B2799，据报道称在所有亚型中，B2705分布最广，遍及世界各地的各族人群，且在所有人种中为主要优势亚型，是目前所发现亚型的原型，其他以此作为模板突变而来，HLA－B2704、06、07只在东方人种中发现，其中B2704是主要亚型，约占55%［6，7］。B2704等位基因阳性百分率从国内地理分布来看，从北向南也具有逐渐递增趋势，而B2705的分布趋势则相反［8］。

本实验中，随机选取91例流式细胞仪检测及PCR检测均为阳性的样本，用HLA－B27分型试剂盒分型检测，结果88例表现为B2704/25（条带1、5、8阳性），占96.7%，是主要型别；1例表现为B2705（条带1、2、4、8阳性），占1.10%；2例表现为 HLAB27阳性（条带8阳性），但无型别，占2.20%。宁德市地处东南沿海，符合B2704、2705的分布规律。另外两例阳性型别未确定样本，还需要进一步进行研究。

［1］汪 薇，李志强.HLA－B27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性研究［J］.临床输血与检验，2009，11（4）：376.

［2］阎 欢，王 薇，胡志东.强直性脊柱炎患者 HLA－B27亚型与KIR基因相关性研究［J］.陕西医学杂志，2012，41（3）：281.

［3］C.E.M.Voorter，W.T.N.Swelsen，E.M.van den Berg－Loonen，et al.B27in molecular diagnostics：Impact of new alleles and polymorphism outside exons 2and 3［J］.Tissue Antigens，2002，60：25－35.

［4］汪 薇，李志强.HLA－B27基因亚型与强直性脊柱炎临床特征的相关性［J］.临床输血与检验，2010，12（1）：31.

［5］胡晓舟，苑 腾，王小林.流式细胞术与定量PCR法检测 HLAB27的比对［J］.中国实验诊断学，2009，13（6）：745.

［5］汪 薇，李志强.强直性脊柱炎患者HLA－B27基因亚型及序列研究［J］.中国输血杂志，2011，24（9）：743.

［7］程四国，王艺芳，张伯伟.HLA－B27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性调查［J］.中国输血杂志，2010，23（5）：392.

［8］陆 君，汪 薇，李志强.强直性脊柱炎患者HLA－B27基因亚型及序列研究［J］.中国输血杂志，2011，24（9）：743－745.