猪流行性腹泻病毒流行毒株COE基因的原核表达及免疫原性分析

霍军++宋予震++董青

摘要：应用RT-PCR方法从PEDV流行毒株中扩增COE基因，并将其克隆至原核表达载体pET-32a，构建 pET-32a-COE 重组质粒。将重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，加入IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示，该重组蛋白获得了表达，主要以包涵体形式存在，分子量约为35.5 ku；Western-blot分析结果显示，所表达的重组蛋白能与抗PEDV小鼠血清反应。应用纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂免疫6周龄BALB/C小鼠并采集血清，ELISA检测抗体效价达1 ∶3 200以上，说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。

关键词：猪流行性腹泻病毒；COE基因；原核表达；免疫原性；诊断抗原；PED基因工程疫苗

中图分类号： S858.285.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0034-02

收稿日期：2013-12-03

基金项目：2013年度河南省科技计划（编号：132102110147）。

作者简介：霍军（1962—），男，河南信阳人，副教授，研究方向为动物解剖生理。Tel：（0371）65765528；E-mail：huojun@tom.com。猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，临床上以猪的急性肠炎、呕吐、腹泻、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征[1]。由于PEDV感染所引起的疾病与猪传染性胃肠炎在临床上难以区分，因此，对于PED的鉴别诊断往往需要借助实验室手段。

S蛋白是冠状病毒囊膜上的糖蛋白，负责病毒的吸附、融合和侵入宿主细胞，也是诱导宿主体液免疫反应的免疫原性蛋白。目前研制的冠状病毒基因工程疫苗所选取的抗原基因主要集中在S基因上[2-4]。Chang等报道，猪流行性腹泻病毒S基因存在中和抗原表位（COE），Brl/87株的COE基因为S基因序列的1 495～1 914 bp[5]；而韩国PEDV株的COE基因为S基因序列的1 504～1 923 bp[6]。本试验结合上述文献，成功扩增了PEDV流行毒株CH/HNZZ/13株S基因的 1 474～1 950 bp 处（包括COE基因），将其连接至pET-32a原核表达质粒进行表达，进而探讨将原核表达的重组COE蛋白作为诊断抗原的可行性；并为PED基因工程疫苗的研制提供参考。

1材料与方法

1.1PEDV阳性样本

2013年采集于河南省郑州郊区某猪场PEDV阳性粪便样本，命名为CH/HNZZ/13株。

1.2主要试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T载体、鼠源反转录酶（M-MLV）、RNA酶抑制剂（Rnase Inhibitor）、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自大连宝生物工程有限公司；Bradford蛋白质定量试剂盒购自TIANGEN公司；TRIzon Regent、 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒、DAB显色试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3PCR引物的设计

参考PEDV CV777株全基因序列（GenBank：AF 353511）设计1对特异性引物，上游引物为CGGATCCCTTCTGAGTCACGAACAG，加入酶切位点BamHⅠ；下游引物为CCTCGAGGGTACACACATCCAGAGTCAT，加入酶切位点XhoⅠ。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4样本处理及RNA的提取

将粪便样本用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）进行10倍稀释并研磨，8 000 r/min离心10 min取上清备用，参照说明书使用TRIzon Regent提取RNA。

1.5反转录与PEDV S基因片段的扩增

20 μL反转录体系：RNA模板10 μL，5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，下游引物1 μL（20 pmol/μL），RNase抑制剂（40 U/μL）0.5 μL，反转录酶M-MLV（200 U/μL）0.5 μL，补加灭菌双蒸水至20 μL；反应条件为：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。50 μL PCR扩增体系：10×buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）5 μL，反转录产物（cDNA）5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，rTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，补加灭菌双蒸水至50 μL。反应循环参数：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；循环结束后再72 ℃ 10 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的片段连接至pMD18-T载体，阳性重组质粒命名为pMD18-T-COE。

1.6pET-32a-COE重组质粒的构建及表达

使用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对pET-32a空质粒和pMD18-T-COE进行双酶切，回收目的片段，并使用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，阳性重组质粒命名为pET-32a-COE。将阳性重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，在菌液D600 nm值为0.6～0.8时加入终浓度为1 mmol/mL的IPTG（Isopropylthio-β-D-galactoside），37 ℃条件下进行诱导表达。取诱导后的菌液1 mL于10 000 r/min离心5 min收集沉淀，加入细菌裂解液将其混匀后使用超声波破碎菌体，破碎完全后10 000 r/min离心5 min后，分别取上清和沉淀加入适量的2×SDS凝胶上样缓冲液后沸水煮 5 min，然后再8 000 r/min离心5 min后取上清进行SDS- PAGE电泳分析，检测目的蛋白的表达形式。

1.7目的蛋白纯化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，使用Bradford蛋白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。然后将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，与抗PEDV小鼠阳性血清反应，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG进行作用，最后使用DAB进行显色观察。

1.8目的蛋白的动物免疫试验及ELISA检测

取6周龄左右昆明鼠20只，分成2组，每组10只。试验组小鼠第一次免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏完全佐剂；2周后进行二免，每只小鼠免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏不完全佐剂；2周后三免，方法与二免相同。对照组在3次免疫时均注射0.1 mL生理盐水。三免后2周小鼠眼球采血进行ELISA检测，使用的ELISA方法为本实验室建立的基于PEDV全病毒包被的抗体检测ELISA。

2结果与分析

2.1pET-32a-COE重组质粒构建

通过RT-PCR方法扩增PEDV COE基因，连接至pET-32a原核表达质粒。对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，结果双酶切鉴定时在5 900 bp和491 bp左右有2条带，PCR鉴定时在491 bp有1条特异性条带（图1），表明重组pET-32a-COE质粒构建成功。

2.2融合蛋白的诱导和纯化

对含有重组质粒的E.coli BL21进行诱导表达，经 SDS-PAGE 电泳分析，重组表达质粒在E.coli BL21中以包涵体蛋白的形式表达，其相对分子质量约为35.5 ku，与预测大小相符。使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，SDS-PAGE显示纯化后蛋白在35.5 ku处有单一条带（图2），说明回收纯化效果较好；将重组蛋白进行复性，然后使用Bradford蛋白质定量试剂盒对重组蛋白进行定量，蛋白浓度为0.21 mg/mL。

2.3表达产物的Western-blot分析

以纯化的重组蛋白为抗原，以抗PEDV小鼠阳性血清为一抗进行Western-blot检测，结果在35.5 ku处出现l条清晰的反应条带，说明重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达并具有生物学活性（图2）。

2.4重组蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗体检测ELISA方法检测重组蛋白免疫小鼠后的血清抗体产生情况。ELISA检测结果表明，在重组蛋白中加入弗氏佐剂免疫小鼠，在三免后2周试验组小鼠的血清中ELISA抗体效价可达1 ∶3200，而对照组未检测到PED抗体。

3讨论

本试验成功构建pET32-a-COE重组质粒并进行诱导表达，结果显示目的蛋白主要以包涵体形式存在。虽然以包涵体形式表达的蛋白有一定缺点，主要是对包涵体的处理要先变性溶解后再进行复性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且复性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的优点，能够避免细胞内蛋白质水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分离纯化，适合大规模商品化生产。本研究使用的pET-32a原核表达载体本身带有His标签，可以在变性条件下用 Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化，然后再经复性处理获得具有活性的目的蛋白。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析后显示在35.5 ku处出现单一条带，未见杂带，说明对目的蛋白纯化效果良好。Western-blot分析结果显示，所表达的重组蛋白能与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清反应，表明所表达的重组蛋白具有良好的反应原性，可以作为诊断抗原用于PEDV抗体的检测。另外，将纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂后免疫小鼠，可诱使小鼠机体产生高水平的PED抗体，说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹泻疫情在我国仍然十分严重，因此，急需建立可靠的PEDV抗体检测方法用于PED流行病学的监测以及猪群免疫PED疫苗后抗体水平的检测。本试验表达的针对PEDV COE基因主要抗原区的重组蛋白表达量高、反应原性好，为PEDV抗体检测试剂盒的研发提供了参考。另外，由于所表达的蛋白具有良好的免疫原性，也为将该蛋白作为PED基因工程疫苗候选抗原的研究提供依据。

参考文献：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韦显凯，侯继波，姜平. 表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性[J]. 中国兽医学报，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董丽娜，高凤山，许崇波，等. 表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志强，俞红贤，荆海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：36-39.

1.7目的蛋白纯化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，使用Bradford蛋白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。然后将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，与抗PEDV小鼠阳性血清反应，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG进行作用，最后使用DAB进行显色观察。

1.8目的蛋白的动物免疫试验及ELISA检测

取6周龄左右昆明鼠20只，分成2组，每组10只。试验组小鼠第一次免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏完全佐剂；2周后进行二免，每只小鼠免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏不完全佐剂；2周后三免，方法与二免相同。对照组在3次免疫时均注射0.1 mL生理盐水。三免后2周小鼠眼球采血进行ELISA检测，使用的ELISA方法为本实验室建立的基于PEDV全病毒包被的抗体检测ELISA。

2结果与分析

2.1pET-32a-COE重组质粒构建

通过RT-PCR方法扩增PEDV COE基因，连接至pET-32a原核表达质粒。对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，结果双酶切鉴定时在5 900 bp和491 bp左右有2条带，PCR鉴定时在491 bp有1条特异性条带（图1），表明重组pET-32a-COE质粒构建成功。

2.2融合蛋白的诱导和纯化

对含有重组质粒的E.coli BL21进行诱导表达，经 SDS-PAGE 电泳分析，重组表达质粒在E.coli BL21中以包涵体蛋白的形式表达，其相对分子质量约为35.5 ku，与预测大小相符。使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，SDS-PAGE显示纯化后蛋白在35.5 ku处有单一条带（图2），说明回收纯化效果较好；将重组蛋白进行复性，然后使用Bradford蛋白质定量试剂盒对重组蛋白进行定量，蛋白浓度为0.21 mg/mL。

2.3表达产物的Western-blot分析

以纯化的重组蛋白为抗原，以抗PEDV小鼠阳性血清为一抗进行Western-blot检测，结果在35.5 ku处出现l条清晰的反应条带，说明重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达并具有生物学活性（图2）。

2.4重组蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗体检测ELISA方法检测重组蛋白免疫小鼠后的血清抗体产生情况。ELISA检测结果表明，在重组蛋白中加入弗氏佐剂免疫小鼠，在三免后2周试验组小鼠的血清中ELISA抗体效价可达1 ∶3200，而对照组未检测到PED抗体。

3讨论

本试验成功构建pET32-a-COE重组质粒并进行诱导表达，结果显示目的蛋白主要以包涵体形式存在。虽然以包涵体形式表达的蛋白有一定缺点，主要是对包涵体的处理要先变性溶解后再进行复性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且复性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的优点，能够避免细胞内蛋白质水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分离纯化，适合大规模商品化生产。本研究使用的pET-32a原核表达载体本身带有His标签，可以在变性条件下用 Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化，然后再经复性处理获得具有活性的目的蛋白。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析后显示在35.5 ku处出现单一条带，未见杂带，说明对目的蛋白纯化效果良好。Western-blot分析结果显示，所表达的重组蛋白能与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清反应，表明所表达的重组蛋白具有良好的反应原性，可以作为诊断抗原用于PEDV抗体的检测。另外，将纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂后免疫小鼠，可诱使小鼠机体产生高水平的PED抗体，说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹泻疫情在我国仍然十分严重，因此，急需建立可靠的PEDV抗体检测方法用于PED流行病学的监测以及猪群免疫PED疫苗后抗体水平的检测。本试验表达的针对PEDV COE基因主要抗原区的重组蛋白表达量高、反应原性好，为PEDV抗体检测试剂盒的研发提供了参考。另外，由于所表达的蛋白具有良好的免疫原性，也为将该蛋白作为PED基因工程疫苗候选抗原的研究提供依据。

参考文献：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韦显凯，侯继波，姜平. 表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性[J]. 中国兽医学报，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董丽娜，高凤山，许崇波，等. 表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志强，俞红贤，荆海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：36-39.

1.7目的蛋白纯化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，使用Bradford蛋白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。然后将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，与抗PEDV小鼠阳性血清反应，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG进行作用，最后使用DAB进行显色观察。

1.8目的蛋白的动物免疫试验及ELISA检测

取6周龄左右昆明鼠20只，分成2组，每组10只。试验组小鼠第一次免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏完全佐剂；2周后进行二免，每只小鼠免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏不完全佐剂；2周后三免，方法与二免相同。对照组在3次免疫时均注射0.1 mL生理盐水。三免后2周小鼠眼球采血进行ELISA检测，使用的ELISA方法为本实验室建立的基于PEDV全病毒包被的抗体检测ELISA。

2结果与分析

2.1pET-32a-COE重组质粒构建

通过RT-PCR方法扩增PEDV COE基因，连接至pET-32a原核表达质粒。对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，结果双酶切鉴定时在5 900 bp和491 bp左右有2条带，PCR鉴定时在491 bp有1条特异性条带（图1），表明重组pET-32a-COE质粒构建成功。

2.2融合蛋白的诱导和纯化

对含有重组质粒的E.coli BL21进行诱导表达，经 SDS-PAGE 电泳分析，重组表达质粒在E.coli BL21中以包涵体蛋白的形式表达，其相对分子质量约为35.5 ku，与预测大小相符。使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，SDS-PAGE显示纯化后蛋白在35.5 ku处有单一条带（图2），说明回收纯化效果较好；将重组蛋白进行复性，然后使用Bradford蛋白质定量试剂盒对重组蛋白进行定量，蛋白浓度为0.21 mg/mL。

2.3表达产物的Western-blot分析

以纯化的重组蛋白为抗原，以抗PEDV小鼠阳性血清为一抗进行Western-blot检测，结果在35.5 ku处出现l条清晰的反应条带，说明重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达并具有生物学活性（图2）。

2.4重组蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗体检测ELISA方法检测重组蛋白免疫小鼠后的血清抗体产生情况。ELISA检测结果表明，在重组蛋白中加入弗氏佐剂免疫小鼠，在三免后2周试验组小鼠的血清中ELISA抗体效价可达1 ∶3200，而对照组未检测到PED抗体。

3讨论

本试验成功构建pET32-a-COE重组质粒并进行诱导表达，结果显示目的蛋白主要以包涵体形式存在。虽然以包涵体形式表达的蛋白有一定缺点，主要是对包涵体的处理要先变性溶解后再进行复性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且复性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的优点，能够避免细胞内蛋白质水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分离纯化，适合大规模商品化生产。本研究使用的pET-32a原核表达载体本身带有His标签，可以在变性条件下用 Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化，然后再经复性处理获得具有活性的目的蛋白。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析后显示在35.5 ku处出现单一条带，未见杂带，说明对目的蛋白纯化效果良好。Western-blot分析结果显示，所表达的重组蛋白能与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清反应，表明所表达的重组蛋白具有良好的反应原性，可以作为诊断抗原用于PEDV抗体的检测。另外，将纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂后免疫小鼠，可诱使小鼠机体产生高水平的PED抗体，说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹泻疫情在我国仍然十分严重，因此，急需建立可靠的PEDV抗体检测方法用于PED流行病学的监测以及猪群免疫PED疫苗后抗体水平的检测。本试验表达的针对PEDV COE基因主要抗原区的重组蛋白表达量高、反应原性好，为PEDV抗体检测试剂盒的研发提供了参考。另外，由于所表达的蛋白具有良好的免疫原性，也为将该蛋白作为PED基因工程疫苗候选抗原的研究提供依据。

参考文献：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韦显凯，侯继波，姜平. 表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性[J]. 中国兽医学报，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董丽娜，高凤山，许崇波，等. 表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志强，俞红贤，荆海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：36-39.