人脂联素基因重组腺病毒对内皮细胞MCP－1和ICAM－1表达的影响

王桂杰，冷吉燕，卢新卫，张 婧，葛媛媛

（吉林大学第一医院 干部病房，吉林 长春130021）

脂联素（adiponectin，ADPN）是脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白质，具有改善胰岛素抵抗、抗炎、抗动脉粥样硬化、降血糖、保护血管内皮等作用［1］，生理浓度范围内的脂联素通过抑制NF－κB信号传导通路能够剂量依赖性地抑制肿瘤坏死因子（TNF－α）诱导的血管内皮细胞黏附分子的表达。本研究通过将人脂联素基因重组腺病毒感染人脐静脉内皮细胞（human umbilical veins endothelial cells，HUVECs），研究其对人脐静脉内皮细胞分泌单核细胞超化因子1（MCP－1）和细胞间粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM－1）和mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

主要试剂：DMEM高糖培养基和胎牛血清（美国GIBCO公司）；人脂联素ELISA检测试剂盒（美国RD公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）和台盼蓝（德国Sigma）；人脂联素基因重组腺病毒（Ad－apM1）和报告基因LacZ重组腺病毒（Ad－LacZ）由本课题组构建和制备。

细胞：低代数的HEK293细胞株（中国科学院上海细胞生物学研究所）；新生儿无菌脐带采集自吉林大学第一医院妇产科。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒的制备、扩增、纯化和滴度测定 从人脂肪组织克隆人脂联素基因apM1，利用基因重组方法将其构建到腺病毒粘粒载体pAxCAwt，应用COS/TPC方法，将左向转录的重组腺病毒粘粒载体pAxCAwt1apM1、pAx－CAwt1LacZ（对照腺病毒）分别与 Ad5DNA－TPC共转染HEK293细胞，经同源重组产生重组腺病毒。在HEK293细胞中大量扩增病毒，病毒上清经氯化铯密度梯度离心纯化后保存于－80℃备用。用50% 组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度。

1.2.2 人脐静脉内皮细胞的体外培养 参照 Nachman等［2］方法，在无菌条件下取健康新生儿脐带25－30cm，灌入0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃ 消化10min。离心收集内皮细胞，用完全M199［含20%胎牛血清、内皮生长因子（endothelial cell growth factor，ECGF）20mg/L、青霉素1×105U/L和链霉素100mg/L］接种细胞于T25细胞培养瓶中，置37℃，5%CO2培养箱中培养。当细胞融合成单层时，以0.02%乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）消化传代，实验用第1－3代。

1.2.3 实验分组 将细胞随机分为4组：对照组、TNF－α刺激组（以20μg/L TNF－α刺激）、空载体转染组（先以20μg/L的TNF－α刺激，然后用半自动光学检查仪（manual optical Znspector，MOI）为50的 Ad－LacZ转染 HUVECs）和脂联素转染组（先以20μg/L的TNF－α刺激，然后用 MOI为50的脂联素重组腺病毒转染HUVECs）。各组细胞培养24、48、72h后分别取上清备用。

1.2.4 HUVECs中脂联素蛋白水平的检测：按照人脂联素的ELISA试剂盒说明书测定标准品及各孔细胞培养上清液中脂联素蛋白含量。450nm可见光比色的吸光值（A）对标准品中脂联素蛋白含量绘制标准曲线，将细胞上清液中测得的吸光值在标准曲线上确定其中脂联素蛋白含量。

1.2.5 HUVECs中 MCP－1和ICAM－1蛋白水平的检测：采用双抗体夹心ABC－ELISA方法进行检测。将分组处理后的细胞分别取细胞上清液100μl，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，最后于酶标仪490nm处读数，并将数值按照标准曲线转换成相应浓度值。

1.2.6 MCP－1和ICAM－1mRNA 表达的检测：转染 HUVEC后7d收集细胞。按照说明书，采用T rizol法提取总RNA，并测定其浓度及纯度。取2μgRNA进行逆转录，合成cDNA。以此为模板用ICAM－1、MCP－l引物经PCR方法进行 扩 增。ICAM－1 正 义 链 5’－CACAGGTGGTGCTTCTGAAC－3’，反义链5’－C 代 CTGAGCCTTCTGTAACTTG－3’。MCP－1 正 义 链 5’－GGTGTCCCAAAGAAGCTGTAG－3’，反义链5’－TC代 TGTCATACTGGTCACTTC－3’。内参CAPDH 正义链 5’－AAGAACAGGCTCTTAGCA－3’，反 义链5’－CCAGTAGACTCCACGACAT－3’。ICAM－1 的 扩 增条件：95℃5min，94℃1min，57℃1min，72℃2min，共35个循环，最后72℃延伸10min，终产物为496bp。MCP－l的引物扩增条件：95℃5min，94℃1min，52℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终产物为283bP。应用凝胶成像分析系统分析图像，结果用目的片段/GApDH片段的条带吸光度（A）比值表示。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本间均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组腺病毒的扩增、纯化和滴度测定 Ad－apM1和Ad－LacZ在HEK293细胞中获得了大量扩增，经氯化铯密度梯度离心纯化后，TC ID50测定病毒滴度为2×1011PFU/ml。

2.2 原代及传代HUVECs的鉴定 原代培养时，细胞接种后4h开始贴壁生长，贴壁细胞呈扁平多角形或梭形，边界清楚，胞质丰富，细胞核为圆形或椭圆形，核内染色质稀疏空亮，核仁1或2个；细胞为单层，互不重叠，细胞间相互连接呈铺路石状镶嵌排列。传代细胞中可见多个双核及核分裂细胞，有时可见多核及巨细胞。

2.3 重组腺病毒对内皮细胞的感染率 MOI为50时，HUVEC的感染效率约90%。

2.4 人脂联素基因重组腺病毒蛋白的表达 用MOI为50的人脂联素基因重组腺病毒感染 HUVECs24、48、72h后，取上清检测脂联素浓度分别为（123±14）ng/ml、（161±15）ng/ml、（150±10）ng/ml。TNF－α刺激组、空载体转染组和对照组24、48、72h均未检测到脂联素蛋白。

2.5 各组HUVECs MCP－1和ICAM－1蛋白及 mRNA的表达 TNF－α刺激组和空载体转染组MCP－1和ICAM－1的蛋白及mRNA表达水平明显高于对照组（P＜0.01）；与TNF－α刺激组和空载体转染组相比，脂联素转染组HUVECs MCP－1、ICAM－1蛋白及 mRNA的表达明显降低（P＜0.01）。（表1、2）

表1 各组HUVECsICAM－l和MCP－l蛋白表达（±s）

表1 各组HUVECsICAM－l和MCP－l蛋白表达（±s）

注：a与空白对照组比较，P＜0.01；b与TNF－α刺激组比较，P＜0.01；c与空载体转染组比较，P＜0.01。

组别 MCP－1（ng/L） ICAM－1（ng/L）265.8±46.84 406.36±98.34 TNF－α刺激组 1653.6±66.45a 2104.57±78.55a空载体转染组 1633.5±71.14a 2136.43±89.36a脂联素转染组 458.4±54.37bc 475.76±69.31对照组bc

表2 各组 HUVECsMCP－l和ICAM－lmRNA表达（相对A，±s）

表2 各组 HUVECsMCP－l和ICAM－lmRNA表达（相对A，±s）

注：a与空白对照组比较，P＜0.01；b与 TNF－α刺激组比较，P＜0.01；c与空载体转染组比较，P ＜0.01。

0.452±0.035 0.258±0.023 TNF－α刺激组 1.232±0.064a 0.602±0.058a空载体转染组 1.245±0.057a 0.613±0.043a脂联素转染组 0.453±0.055bc 0.291±0.024 MCP－1mRNA ICAM－1mRNA对照组组别bc

3 讨论

脂肪组织除了具有储存能量的功能外，还具有活跃的内分泌功能［3］，其合成和分泌的多种具有血管活性的激素和细胞因子，统称为脂肪因子。目前已知脂肪组织分泌的脂肪因子有瘦素（leplin）、TNF－α、纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibi－tor，PAI）、抵 抗 素 （resistin）、白 介 素－6（IL－6）、脂联素，其中，脂联素是脂肪细胞分泌的一种较为特异的蛋白质，具有胰岛素样血管活性，其抗动脉粥样硬化及抗炎作用而备受关注［4］。脂联素与TNF－α在高级结构上具有高度的相似性，均通过三聚化球状结构域与受体结合。研究显示，脂联素的许多抗炎作用是通过抑制TNF－α介导实现的［5］。人体内血浆脂联素浓度为5－30mg/L，在血浆中主要以全长脂联素和球形脂联素两种形式起作用，后者生理作用更为重要。脂联素涉及脂质代谢紊乱、血管内皮细胞损伤、巨噬细胞及T细胞浸润、平滑肌细胞增生、血小板黏附等多种病理生理过程，在内皮细胞炎症反应和动脉粥样硬化发生发展过程中发挥着重要作用。

ICAM－1是介导细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用的糖蛋白，在动脉粥样硬化等病理过程中起着重要作用。MCP－1对单核或巨噬细胞有趋化和激活作用，可诱导其产生白介素－6，促进黏附分子表达。人们认为内皮细胞、白细胞和血小板之间以及与血管内皮基质间相互黏附、相互作用而导致炎症反应，从而促进动脉粥样硬化斑块的形成和发展［6］。当细胞活化时，ICAM－1的表达量迅速上升［7］，可使内皮细胞易于“捕获”中性粒细胞，并促进其迁入动脉壁，促进斑块内炎症反应。高水平MCP－1可以吸引单核细胞黏附并浸润动脉壁，这一过程促使粥样斑块更进一步形成。ICAM－1可介导白细胞与内皮细胞的滚动和稳定黏附，并继而在MCP－1等炎性因子的协助下穿越血管表层［8］，介导单核细胞和T细胞的滚动和黏附，启动局部的炎症反应。

本研究首先观察了TNF－α在体外对脐静脉内皮细胞的刺激作用，结果显示，血管内皮细胞经TNF－α刺激后，MCP－1、ICAM－1的蛋白和mRNA表达增加，说明TNF－α对血管内皮具有损伤作用。通过腺病毒载体将脂联素基因导入HUVECs，发现重组脂联素能够抑制TNF－α引起的 MCP－1、ICAM－1蛋白和mRNA的表达的增高，提示脂联素通过抑制MCP－1、ICAM－1表达，而具有重要的抗炎、抗动脉粥样硬化和心血管保护作用。正如发现TNF－α在炎症中的重要作用而出现的以TNF－α为靶标的生物制剂，深入研究重组脂联素在动脉粥样硬化发病过程中的作用，可能为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶标和方向。

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