1株猪源乙型脑炎病毒株的免疫原性研究

唐波　张道华　张雪花等

摘要：将从江苏地区筛选出的1株增殖性能稳定猪源JEV JS01毒株作为疫苗，用毒株制备灭活疫苗进行免疫原性研究。试验采用经过细胞传代获得JEV JS01病毒液（1×107.5 TCID50/mL），以甲醛灭活后加入油佐剂，制备猪源乙型脑炎灭活疫苗。腹腔免疫9～12 g小鼠，攻毒保护结果显示对照组小鼠全部死亡，免疫组90%以上健活。分别肌肉注射免疫仔猪及后备母猪，不同时间采集血清测定JEV ELISA抗体。检测结果显示，免疫后试验猪血清抗体效价较免疫前均有显著提高，后备母猪免疫8个月后抗体仍全部为阳性，抗体水平与免疫剂量呈正相关性。试验表明该猪源乙脑病毒JS01毒株具有良好的免疫原性，可以用作疫苗用毒株。

关键词：猪源乙型脑炎病毒；免疫原性；灭活疫苗

中图分类号： S855.99文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0306-02

收稿日期：2015-05-28

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（11）2047]；江苏省科技支撑计划（编号：BE2012370）。

作者简介：唐波（1982—），男，江苏海安人，硕士，助理研究员，主要从事动物分子病原学及免疫学研究。Tel：（025）84392058；E-mail：2005107058@163.com。

通信作者：张道华，研究员，主要从事动物分子病原学及免疫学研究。Tel：（025）84392058；E-mail：zhangdh2005@163.com。流行性乙型脑炎病是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus）引起的一种人兽共患传染病[1]。人感染后主要表现脑炎神经症状，但并不传播。猪乙型脑炎病主要表现为公猪睾丸炎、母猪繁殖障碍等，多数猪呈隐性感染并表现病毒血症的形式[2]。患乙型脑炎病以及隐性感染的猪在病毒血症阶段都可成为最主要的传染源，在自然界总构成猪→蚊→人的链式传播[3]。该病的流行给养猪业带来巨大经济损失，每年给我国养猪业造成的经济损失达数十亿元[4]。鉴于感染乙型脑炎的猪是人类乙型脑炎的重要传染源，因此猪乙型脑炎的防治在公共卫生方面也具有极其重要的意义[5]。

目前防治猪乙型脑炎病最经济有效的方法仍是接种疫苗[6]。我国预防猪群流行性乙型脑炎与人乙脑防控应用的是同一弱毒株SA14-14-2株弱毒活疫苗，虽然已证实该毒株在人类应用的安全性和有效性[7～8]，但是在猪群中广泛接种人用乙脑减毒活疫苗的合理性、潜在的危害性还是越来越引起人们关注。本研究用经过传代筛选获得1株增殖性能稳定的猪源JEV毒株作为疫苗候选株进行相关免疫原性研究，为研制高效、安全的BHK-21传代细胞系猪源乙型脑炎灭活疫苗打下基础。

1材料与方法

1.1细胞及毒株

BHK-21 细胞系购买自ATCC，JEV JS01毒株由江苏省农业科学院分离、鉴定和保存。

1.2主要试剂

DMEM 培养基和胎牛血清 （FBS） 购自 GIBCO公司；猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；乙型脑炎弱毒活疫苗购自上海海利生物药品有限公司。

1.3病毒培养及含量测定

将细胞生长覆盖率达80%的BHK21细胞培养物，去生长液。按感染复数为0.2%～0.5%接种JEV-JS株F4代病毒液，加入含2%FBS的DMEM液，35 ℃培养。当显微镜下观察到细胞达75% CPE（细胞病变）时，冻融收获病毒液。96孔板测定病毒滴度，将病毒液用DMEM液作10倍系列稀释，取10-1～10-7稀释度分别接种，每孔接种量为0.1 mL，同时设立DMEM液阴性对照孔。35 ℃下培养，观察CPE，计算TCID50。

1.4灭活疫苗的制备

在病毒液中加入终浓度达到0.1%甲醛，于37 ℃作用 48 h，其间每隔6 h搅拌或振摇1次，获得灭活后的病毒液。将灭活后的病毒液进行灭活检验，用DMEM液1 ∶10稀释后，接种细胞同时设立阴性对照孔，37 ℃下培养，观察细胞病变（CPE）。盲传3代，如果无细胞病变（CPE）则表明灭活完全。由灭菌的吐温-80与灭活病毒液按体积比例4 ∶96混合均匀组成水相。按照体积比为3 ∶1将油相和水相进行混合并乳化，制备灭活疫苗。

1.5JEV JS01免疫原性研究

1.5.1小鼠免疫原性试验9～11 g清洁级健康小鼠90只，随机分成9组，每组10只。1组为对照组，注射无菌PBS缓冲液；4组为弱毒活疫苗组，分别取弱毒活疫苗10-1～10-4 4个稀释度腹腔注射0.1头份/只；另外4组腹腔接种猪乙型脑炎灭活疫苗，接种剂量分别为0.1、0.05、0.025、 0.012 5 mL/只，间隔7 d后用同等剂量加强免疫1次；加强免疫7 d后用病毒含量为2×103 LD50/0.2 mL的JEV-JS01株病毒液进行强毒腹腔接种攻击。自攻毒之日起逐日观察至14 d判定结果（3 d内死亡不计）。

1.5.2仔猪免疫原性评价用猪乙型脑炎灭活疫苗肌肉注射40日龄健康仔猪，分0.5、1.0、2.0 mL/头共3个剂量组，每组4头；另设对照组3头，注射生理盐水2 mL/头。免疫后1、2、3、4周分别采血分离血清，用猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒检测血清ELISA抗体的，D630 nm﹥0.32为阳性。

1.5.3后备母猪免疫期及抗体消长规律研究将健康易感后备母猪20头进行分组试验，分为4组，每组5头。其中1组为对照组，其他3组为免疫组。免疫组在配种前45 d肌注猪乙型脑炎灭活疫苗，接种剂量分别0.5、1.0、2.0 mL/头，间隔2周后分别用同等剂量疫苗加强免疫1次。对照组，注射生理盐水2 mL/头。免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月分别采血分离血清，用猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒检测ELISA抗体，D630 nm﹥0.32为阳性。

2结果

2.1病毒培养及滴度测定

病毒接种细胞72 h后（观察CPE达75%时）冻融收获病毒液，测定病毒滴度。用Karber氏法计算出乙脑病毒JS01株F5代病毒含量达到1×107.5TCID50/mL。

2.2小鼠免疫原性试验

在第2次免疫后第7天攻毒，逐日观察至第14天。攻毒后空白对照组的小鼠从第6天开始表现出神经症状逐渐全部死亡，活疫苗各剂量免疫组对小鼠的保护率均为100%（10/10），灭活疫苗各剂量组总健活率为92.5%。结果表明，该病毒制备的白油佐剂灭活疫苗也可以刺激机体产生较好的免疫应答，对小鼠的保护率高（表1）。

表1JEV JS01株攻击免疫小鼠的保护率

组别免疫剂量保护率（%）空白对照0弱毒活疫苗10-110010-210010-310010-4100灭活疫苗0.1 mL1000.05 mL1000.025 mL900.012 5 mL80

2.3仔猪JEV ELISA抗体检测结果

疫苗免疫仔猪后JEV ELISA抗体检测结果表明，所有剂量组仔猪免疫后免疫1周抗体全部转阳，随后抗体效价逐步增高，免疫后2～4周抗体效价均维持较高水平（图1）。表明该JEV JS01株对仔猪具有良好的免疫原性，能够较好地刺激机体产生免疫作用，免疫后仔猪抗体产生快、效价高。

2.4后备母猪免疫期及抗体消长规律

免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月分别采血分离血清测定抗体，结果见图2。不同剂量组疫苗免疫后备母猪2周后ELISA抗体全部转阳，第14天二次免疫后抗体水平均有大幅度的提升。抗体效价在免疫后2周至6个月均能维持在较高的水平，免疫后8个月所有剂量组母猪抗体仍全部为阳性。该结果表明JEV JS01株具有较好的免疫原性，免疫后抗

体水平高且持续时间长。

3讨论

一直以来我国对JEV 的研究大多集中在人源和蚊源株，对猪源性JEV的研究重视不够，对猪源乙脑毒株相关免疫原性的研究很少。近年来，国内外学者陆续从猪体中分离出多株乙脑病毒，关于猪源JEV的报道越来越多[9～10]。然而有研究表明，一些猪源性分离毒株在分子特征上更接近现行弱毒株SA14-14-2，进化树分析表明这些分离株与疫苗株的亲缘关系更近，可能是疫苗株在自然界发生毒力返强或者是与其他毒株在猪体内发生重组所致[11～12]。因此，加大对猪源乙型脑炎病毒灭活疫苗的开发研究，对解决乙脑减毒活疫苗在猪群中使用的潜在危害具有重大意义。

近年来，国内外学者陆续开展了猪源乙型脑炎病毒灭活疫苗的研究工作。乔进平等应用猪源乙脑病毒株GZ0409-31制备灭活疫苗免疫动物，结果表明该病毒制备的灭活疫苗可以刺激机体产生免疫应答和免疫保护性抗体[13]。Yang等应用猪源乙脑病毒KV1899制备灭活疫苗免疫母猪也可以刺激机体产生免疫保护性抗体[14]。良好的灭活疫苗需要有良好的抗原作为基础才能使机体获得最佳的保护性免疫。国内目前尚无商品化的猪源乙脑灭活疫苗。本研究选用免疫原性良好的猪源乙脑病毒研究疫苗的免疫效力，为研制高效、安全的猪乙脑灭活疫苗奠定基础。

本研究选用经BHK-21细胞培养增殖性能稳定JS01株猪源乙脑病毒作为疫苗用毒株，制备的灭活疫苗可以刺激机体产生很好的免疫应答，对小鼠具有较高保护率。所有剂量组疫苗免疫仔猪后1周抗体全部转阳，抗体产生快、效价高。后备母猪免疫后抗体效价在免疫后6个月均能维持在较高的水平，免疫后8个月所有剂量组抗体仍全部为阳性，抗体水平与免疫剂量呈正相关性。免疫试验结果证明该JEV JS01株具有较好的免疫原性， 该病毒制备的灭活疫苗能够刺激机体

产生免疫保护性抗体和长时间免疫应答，可以用作猪源乙脑灭活疫苗用毒株。

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