环介导等温扩增技术在病原菌检测中的应用

刘 芳 黄静敏 何永盛 李传礼

（深圳市计量质量检测研究院 广东深圳 518131）

1 前言

分子生物学技术, 特别是PCR 作为一种简便高效的核酸扩增技术，在食品和卫生安全检测方面发挥着重大作用。但PCR 方法操作过程须通过电泳才能观察到实验结果，不适用于现场检测制约了现场快速检测及基层实验室普及应用。因此，开发一种简易快捷、特异灵敏的核酸扩增检测方法成为当务之急。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, 简称LAMP) 技术是Notomi等[1]首先提出来的, 它依赖于4条特异性引物和一种具有链置换活性的DNA 聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在等温条件下可高效、快速、特异地扩增靶序列。以其特异性强、灵敏度高、快速准确和操作简单等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和预防、动物胚胎的性别鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。与PCR 相比，LAMP 反应在一般恒温条件下进行，所需设备简易、成本相对低廉，同时又能满足快速检测的需要，所以更具推广性，特别适用于基层单位及现场检测，有望成为一种简易的常规检测手段，具有广阔的应用前景。

2 LAMP技术反应原理

LAMP技术是在恒温的条件下敏感、高效、特异的扩增靶基因核酸序列，可分成起始阶段、环扩增阶段和延伸阶段。主要利用2条内引物(FIP，BIP) 和2条外引物(F3，B3)特异性识别靶基因上的6 个特定区域，和具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)进行扩增（图 1）。LAMP具有很高的专一性，因为只有当引物和靶基因上6个特殊区域都发生配对时才能进行扩增反应。通过添加反转录酶还可进行RNA序列的扩增（PTLAMP）。PCR已作为分子生物学一种基本工具，如分子克隆，而LAMP具有的多种特性可快速简便地检测样品的核酸序列。而且通过以下几方面的优化，使LAMP成为快速简便的诊断工具。

2.1 添加环引物

在LAMP法的基础上，在哑铃状结构的5’末端的环状单链部分导入具有互补序列的环引物（LB和LF）,能够增加DNA合成的起点，可缩短扩增时间和增强它的灵敏度[2]。环引物现已普遍用于LAMP的实际应用中。

2.2 实时浑浊度检测

只需一台带孵育功能以保证满足LAMP反应动力学的分光光度计，不需要添加任何检测试剂如荧光试剂。这是因为LAMP扩增反应会产生一种焦磷酸镁的衍生物，此衍生物的生成与生成的扩增产物成正比，有研究表明通过对LAMP反应的实时浑浊度分析，有望对最初样品中的DNA模板进行定量[3]。

2.3 荧光目视试剂

Tomita等[3]在LAMP反应体系中加入钙黄绿素，可对反应终点进行有效判断。钙黄绿素与试剂中的锰离子结合时处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出荧光。这种简单清楚的判断方法使一些设备简陋的实验室的使用不受限制。

图1 靶序列上6个特异区域及引物设计

3 LAMP方法在检测病原体微生物中的应用

LAMP技术初期阶段主要用于多种食源性致病菌的快速检测，已针对沙门氏菌(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希氏菌（Escherichia coli,）、霍乱弧菌(Vibrio cholera e)等食源性致病菌的LAMP 检测方法

3.1 沙门氏菌LAMP检测

沙门氏菌是公认的食源性疾病最常见的病原菌之一，能引起人类肠胃和其他疾病。虽然基于PCR方法快速检测沙门氏菌的方法已经建立，但是需要进行电泳分析并且用到昂贵的热循环系统。2005年Kayoko Ohtsuka 等[5]利用上述LAMP方法对疑被感染沙门氏菌的110个水样鸡蛋中进行抽样,经过缓冲蛋白胨水中37℃、20h 的前增菌, 检测结果显示, PCR 漏检了10%, LAMP及分离培养的检出率为100% , 但LAMP 比分离培养方法更快速、灵敏和特异。朱胜梅等[7]摸索了LAMP 检测沙门氏菌的最佳检测反应条件, 使沙门氏菌的DNA检测灵敏度达10 fg/反应, 特异性100%; 对牛奶样品中检出限为102cfu/ mL。

3.2 大肠埃希氏菌(Escherichia.coli) LAMP检测

大肠埃希氏菌种的一些特殊的血清型菌株具有致病性，能引起人类腹泻，通常称这类大肠杆菌为止泻性大肠埃希氏菌。由于进食致泻性大肠埃希氏菌污染的食品而引起的食源性疾病的发病率居高不下, 因此各国对此非常重视。致泻性大肠埃希氏菌类型多、血清型复杂, 常规检测方法难以有效地实现快速、灵敏和全面地检测。Song 等[13]应用LAMP 技术实现了对肠道侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）和志贺氏菌同源基因ipaH 的检测。整个实验在2 h 内完成, 其检测限达到8 cfu/反应, 与PCR比较, PCR 检测限为8×102cfu/反应。

3.3 流感病毒（Influenza）LAMP检测

流感病毒是引起人类流感的病原体之一，可导致一系列呼吸道疾病，从轻微的上呼吸道症状至急性呼吸窘迫综合症和多器官功能衰竭，甚至死亡。流感病毒早期的快速检测对流感的防控非常重要。Ito等[4]针对流感病毒H1和H3亚型的HA基因及乙型流感病毒NP基因，建立了LAMP检测方法，比商业的免疫层析试剂盒灵敏度和专一性更高。Jayawardena等[5]建立了禽流感H5N1特异LAMP技术，对近十年间人和禽的H5N1流感病毒均有理想的检测效果，其灵敏度高达0.002 pfu／反应。

LAMP 技术现也成功地用于快速即时检测其他重要的病原体，包括麻疹病毒[3]、登革热病毒[7]、军团菌[14]、肺孢子虫性肺炎[1]等。

4 LAMP技术发展方向

LAMP技术初期阶段主要用于多种食源性致病菌的快速检测，而由于该技术敏感性高、等温高效、操作简便，有望成为发展中国家中很多危险传染病的简单快速的诊断方法。

4.1 肺结核（Tuberculosis,TB）LAMP检测

TB是发展中国家中一种主要的传染疾病。虽然现在其发病率在很多发展中国家已有所降低，但是影响范围却有扩大的趋势。TB没有被完全控制其中一个重要的原因是缺乏简便可行且灵敏度比痰涂片检测法高的诊断方法。Iwamoto等[19]建立了检测肺结核分支杆菌、鸟分支杆菌和胞内分支杆菌的LAMP方法，灵敏度和PCR方法相当。Boehme等[16]也建立了LAMP方法用于设备简陋的实验室，样品经过滤预处理，后面操作简便，灵敏度和商用的核酸扩增试验系统相当。

4.2 疟疾（Malaria）LAMP检测

疟疾是严重威胁发展中国家儿童和孕妇健康的疾病之一。快速准确检测疟原虫对疟疾的控制和预防是非常重要的。Han等[18]利用LAMP原理设计引物，能区分4种疟原虫，甚至到种的水平，灵敏度和专一性跟巢式PCR相似。Yamamura 等[25]发明了一种新的快速检测恶性疟原虫的方法，其联合了DNA 滤纸技术、环介导的等温扩增技术和熔解曲线的分析技术，使疟原虫的检出率更加精确，灵敏度、特异性分别为97.8%、85.7%。这些报告说明LAMP技术有望成为发展中国家疟疾控制的有力工具。

LAMP技术除了用于TB和疟疾的检测外，还可用于另外一种发展中国家常见的病原菌艾滋病毒的检测[2]。此外，LAMP还用于非洲锥虫病（昏睡症）的检测[17]，这是常被忽略的热带病。所以快速准确的诊断是非常重要的。Kuboki等[21]首先将LAMP技术应用于检测锥虫,LAMP法能从1 pg总DNA 中成功扩增出布氏锥虫基因,而传统PCR 法在总DNA 样本100 pg以上时才能检测到阳性,前者比后者敏感度高100倍。针对不同靶基因的不同引物组合也成功地区分了冈比亚布氏锥虫、克氏锥虫、布氏锥虫、伊氏锥虫等4 种锥虫。Njiru等[22]建立了检测冈比亚锥虫的LAMP试验方法，灵敏度达到10个寄生虫/mL血。他们利用重复插入移动因子序列作为靶标，成功检出锥虫属亚属，灵敏度高达0.001个寄生虫/ mL血。

LAMP技术还可以用于其他传染病的检测如登革热病毒[7]、埃博拉病毒[6]、乙肝病毒[9]等。至今还没有足够简便、效率高、花费少并适合发展中国家基层实验室通用的核酸扩增试验系统。如上所说，LAMP试验不需要精密温度循环装置, 所用设备简单、花费少,有望发展成为最简便的核酸扩增试验系统，有利于从源头控制疾病的传播。

5 展望

最近一些新技术如芯片实验室等[24]已发展和应用于分析科学的各个领域。芯片实验室（Labon-a-chip）可以理解为把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。尽管芯片实验室的这种理念已应用于PCR方法[20]，但是LAMP方法的简便、灵敏高等优点有望使基于芯片实验室的核酸检测系统发展得更加便利。随着相应诊断试剂盒的开发，LAMP有望成为一种简易的常规检测手段。LAMP是一种便捷、特异而又灵敏的基因检测技术，进一步优化、完善后将在遗传病和传染病的早期诊断方面有很大的应用潜力。

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