超高效液相色谱－串联质谱法检测动物源性食品4种β-受体激动剂

2013-09-17张林田陆奕娜

质量安全与检验检测 2013年6期

张林田林文陆奕娜林超

(汕头出入境检验检疫局广东汕头 515041)

1 前言

β-受体激动剂在临床上用于要用于扩张支气管和增加肺通气量的治疗，但当大剂量用药时，在动物身上就表现出脂肪分解增强，蛋白质合成增加，可显著提高瘦肉率和饲料转化率，在畜牧业上又称之为瘦肉精。人吃了含有瘦肉精的食品后表现出呼吸加剧、体温升高、头痛、心悸、代谢紊乱、出现震颤等症状，可诱发和加重心脑血管病人的病情，因此世界各国都先后将其列为动物性食品中禁用药物。自2002年起我国将克伦特罗列为食品动物禁用兽药后，不法分子不断制造出新的瘦肉精品种，如近期湖南查获了在饲料中添加以前未出现过的瘦肉精新品种苯乙醇胺A的案件，这再次为食品安全敲响警钟。

目前，动物源性食品中瘦肉精的检测标准及文献资料较多[1-7]，但适用范围大都仅限于猪肉、猪尿、饲料，而未涉及羊肉、蛇肉、鸡肉及动物性制品如火腿肠、腊肉等；同时动物性食品中的苯乙醇胺A的检测资料则非常少。本文通过对畜禽肉、蛇肉、动物性制品中克伦特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A及马步特罗的检测技术进行研究，建立了快速、准确、灵敏、高效的UPLC-MS/MS测定方法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要仪器

超高效液相色谱-串联质谱联用仪：Thermo TSQ QUANTUM ULTRA/戴安3000；均质器：IKA公司；旋涡混匀器：IKA公司；高速冷冻离心机：日立 CR21GⅢ；电热恒温振荡水槽：上海一恒；氮吹浓缩仪：EYELA MG-2200；SPE固相萃取装置：Supelco。

2.1.2 主要试剂

甲醇、乙腈、甲酸：均为TEDIA HPLC级；乙酸铵：Dikmapure；0.2mol/L 乙酸铵溶液（p H 5.2）；5 mmol/L乙酸铵溶液（加0.1%甲酸）；氨水；5%氨水甲醇溶液(v/v)；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液 (30U/ mL)：MERCK公司。

苯乙醇胺A、莱克多巴胺、克仑特罗、马步特罗标准品：纯度均大于等于99%。克伦特罗-D9（浓度为100 mg/L）：德国DR公司。准确称取上述适量标准品，用甲醇配制成浓度为100 mg/L的标准储备溶液。标准溶液系列用5mmol/L乙酸铵溶液配制。

PCX固相萃取柱：60mg，3mL或相当者，艾杰尔公司。

2.2 方法

2.2.1 液相色谱参考条件

柱温：35℃；进样量：30μL；色谱柱：Waters Atlantis d C18 (100mm×2.1mm)；流速0.3m L/min；流动相：A为乙腈，B为 5mmol/L乙酸铵水溶液（加0.1%甲酸），梯度洗脱程序如下：0-6min，B由2%升到20%，6-10min，B由20%升到70%，保持4min，0.5min内，10-14min，B由70%降到2%，保持2.5min。

2.2.2 质谱参考条件

串联四极杆电喷雾ESI离子源，正离子电离模式；喷雾电压：3000V；雾化室温度：450℃；鞘气流量：35 mL/min；辅助气流量：6 mL/min；毛细管温度：320℃。检测条件如表。

表1 β-受体激动剂的检测条件

2.2.3 样品前处理

2.2.3.1 酶解

准确称取2.0g试样于50 m L离心管中，加入5mL p H 5.2的0.2mol/L乙酸铵缓冲液，1000r/min匀浆1min，再加入β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶溶液40μL,200μL 10μg/L的同位素内标工作溶液，涡旋混匀3min,于37℃电热恒温振荡水槽中水解过夜。将水解液涡旋混匀3min，10000r/min离心10min，上清液经滤纸过滤于10 mL比色管中，残渣再用提取液溶解，混匀、离心、过滤于比色管中，定容摇匀。

2.2.3.2 净化

将经甲醇活化、去离子水洗涤的PCX固相萃取柱连接到固相萃取装置上，取上述提取液5 mL以小于1mL/min的速度过柱，依次用3mL水、3mL甲醇洗涤柱子并彻底抽干，最后用2mL 5%氨水甲醇洗脱。洗脱液在40℃用氮气吹至近干，加0.5 mL流动相溶解，涡旋混匀，14000r/min离心6min，过0.2μm滤膜，待测。

3 结果与讨论

3.1 提取液种类的选择

苯酚型瘦肉精在生物机体内的代谢以轭合态存在，其残留检测必须经过水解过程，常用的水解方法主要有酸解、碱解和酶解等[1-7]。酶水解法常采用β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基硫酸酯复合酶进行水解，该复合酶在p H 5.2及37℃时活性最好，前处理时应严格控制。通常在样品中加入缓冲溶液以控制pH值,如国家标准GB/T21313-2007[2]采用pH值5.2的乙酸铵缓冲液作为提取液。选择37℃水浴恒温水解，水解的时间可根据试验需要适当调整。

3.2 提取方法

多数瘦肉精为中等极性的疏水性物质，呈弱碱性（苯胺型）或酸碱两性（苯酚型），有机溶剂和pH值是影响提取效率的两大因素。一般操作步骤是先将水解液p H至1，离心后的上清液再用10mol/L氢氧化钠调p H至11，再用有机溶剂萃取[1-7]。液-液萃取净化方法是经典方法，但操作烦琐，耗时费力，效率低下，本研究采用水解后直接进行固相萃取柱净化浓缩，简化前处理步骤，提高工作效率，节约试剂能源，经验证，准确度及精密度均符合要求。

图1 4种目标物二级质谱图

3.3 提取次数的影响

在提取过程中，提取次数对回收率有着重要影响，提取次数如不够，提取不完全，目标物损失较多，而提取次数过多，既造成试剂浪费又造成检测时间太长，工作效率低。采用2μg/kg猪肉添加样品，比较提取次数对测定结果的影响，结果见表2。可得出，如只提取一次，则还有部分被测物提取不完全残留在残渣里，第3次提取液则均为未检出。

表2 提取次数对测定结果的影响

3.4 洗脱液体积的选择

洗脱液体积不仅可以保证较高的回收率，还可避免浪费溶剂，缩短试验时间，提高工作效率。取4μg/L的标准混合液过固相萃取柱，考察不同洗脱体积对测定结果的影响，试验结果见表3。试验结果可知，用2mL5%氨化甲醇洗脱时，4种目标物的回收率最大。

表3 固相萃取洗脱体积对测定结果的影响

3.5 流动相的选择

现行有效的瘦肉精检测的标准方法中，大都采用0.1%甲酸和甲醇或乙腈搭配作为流动相，研究比较0.1%甲酸-甲醇与0.1%甲酸-乙腈作为流动相，对比发现，甲醇这组流动相出峰时间相对较缓慢，响应强度比乙腈稍高，但苯乙醇胺A不出峰，相比之下，在同样流速条件下，乙腈这组流动相中4种成分均出峰，出峰时间相比较甲醇这组也稍快些，4种成分均达到最大分离，选择乙腈作为有机相。在流动相水相中加入少许乙酸铵，可明显提高灵敏度，提高信噪比。

3.6 质谱条件的优化

在保持流动相以初始比例运行时，将1mg/L的标准混合溶液用蠕动泵以5μL/min流动注射方式进样，优化质谱条件，选择最优的离子源参数及碰撞能、锥孔电压等参数，结果见表1。4种化合物的二级谱图见图1。

图2 0.5μg/L标液 4种目标物的多反应监测谱图

3.7 标准工作曲线、线性及检出限

用流动相配制浓度分别为0、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/L的标准工作系列，内标浓度为2.0μg/L，按本法分析，绘制标准工作曲线。结果表明，4种化合物在0-10.0μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数r2均＞0.999，回归方程和相关系数列于表4，提取离子多反应监测图见图2。

表4 4种瘦肉精线性回归方程、相关系数

3.8 方法定量检测限

采用0.5μg/L的混合标准溶液色谱图，以峰峰比计算信噪比，结果见表4。以10倍信噪比计算定量检测限，再根据本方法的操作步骤结合文献资料，确定方法定量检测限均为0.5μg/kg。蛇肉、猪肾阴性样品在0.5μg/kg添加水平的提取离子流图见图3-4。

3.9 回收率试验和重复性试验

取猪肉空白样品，按0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg浓度水平添加，做6次平行试验，结果见表5。猪、牛、鸡、鸭、羊、蛇肉、奶粉等基质样品在0.5、1.0、5.0μg/kg 3个浓度水平加标回收率为70.2%-119.8%，6次测定的相对标准偏差3.8%-19.1%。另取猪心、猪肾、猪肝、腊肉、火腿肠等样品，按本法进行检测，也取得较好的结果。