气相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯

马小宁 田 燕 宋小莉 张凤霞 贾 迪 李淑娟 仲维科 刘汉霞

（中国检验检疫科学研究院 北京 100123）

1 前言

婴幼儿配方乳粉作为婴幼儿主要的营养摄入来源，其营养成分和安全指标一直倍受关注。众所周知，母乳是婴儿的首选营养，因此，婴幼儿配方乳粉也经历着逐步模仿和接近母乳的发展历程。

婴幼儿配方乳粉通常选用牛乳为原料，虽然牛乳的脂肪含量与母乳相似[1]，但其脂肪酸组成差异很大。为了满足婴幼儿的生长发育需求，以牛乳为基质的婴幼儿配方乳粉不断发展变化，添加了γ-亚麻酸（C18：3）、花生四烯酸（C20：4）、α-亚麻酸（C18：3）、DHA（C22：6）等不饱和脂肪酸，使其更接近母乳的营养成分特征。棕榈酸（C16:0）是人体最重要的产能脂肪酸，在甘油三酯上的位置分布对脂肪酸的消化和吸收有很大的影响[2-4]。牛乳脂肪中棕榈酸的含量约为26 %，其中sn-2位上仅有32 %为棕榈酸[5]；而母乳脂肪中棕榈酸的含量为20 %-25 %，sn-2位上棕榈酸含量约占总棕榈酸的70 %[6]。许多研究证明，sn-2位棕榈酸能够提高脂肪酸的吸收利用率，促进婴儿对脂肪[7-8]、矿物质[8-10]的吸收，促进婴儿骨骼矿物质的沉积[4]、预防便秘。婴幼儿配方奶粉中添加sn-2位棕榈酸，可使其微观上更接近母乳脂肪的成分，更容易被婴幼儿消化吸收。

1,3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯（1,3-Dioleoyl 2-palmitoyl triglyceride；C52：2，简称OPO)是一种营养强化剂，属于sn-2位棕榈酸。OPO是以植物油为原料，在脂肪酶催化酯交换下，脂肪酸在丙三醇分子上的位置重新排列而得。它作为一种基本脂肪配料，模仿母乳的构成和母乳脂肪的特性，从而能最佳地帮助钙和能量的吸收[11]。2010年上海举行的第六届亚洲及太平洋地区母胎医学大会上，众多知名专家均认同配方奶粉引入OPO达到了迄今为止最为接近母乳的喂哺效果[12]。2008年中华人民共和国卫生部第13号公告批准了OPO作为营养强化剂可用于婴儿配方奶粉的生产，并于2010年中华人民共和国卫生部第1号公告中明确了OPO扩大使用范围及使用量。OPO被作为一种显著有效的营养功能成分正在被广泛的添加到婴幼儿配方乳粉中，国际大型婴幼儿配方乳粉生产企业争相把“添加OPO”作为宣传亮点，大量已经添加“OPO”的婴幼儿配方乳粉正在市场上流通。然而，国内尚无任何关于OPO的检测标准和检测方法，无法衡量婴幼儿配方乳粉中是否添加OPO，添加量如何以及添加范围是否合理安全等问题。因此，亟待建立婴幼儿配方乳粉中OPO定量检测方法。

本研究建立了婴幼儿配方乳粉中OPO含量的测定方法，旨在为保障婴幼儿配方乳粉安全和质量提供技术支持。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

78 90型气相色谱仪：带有多模式进样口（MMI）及FID检测器，Agilent公司；CP-TAP Ultimetal毛细管柱：25 m×0.25 mm×0.05 μm，Agilent公司；旋转蒸发仪：EYELE。

2.1.2 试剂

OPO标准品：货号D1657，纯度≥99%，sigma公司；十七烷酸甘油三酯标准品：货号T2151，纯度≥99%，sigma公司；氦气或氮气：99.995 %，无有机物；氢气：99.995 %，无有机物；空气或氧气：无有机物；正己烷：色谱纯；氨水、酚酞、乙醇、乙醚、石油醚等：均为分析纯。

2.2 方法

2.2.1 样品处理

取样品1-2 g于50 mL试管中，加入8 mL水，溶解后加2 mL氨水，充分摇匀；加入2滴酚酞指示剂，用氨水调溶液呈碱性，转移至150 mL分液漏斗中，加10 mL乙醇摇匀；分两次加入25 mL乙醚，分别摇匀；加入25 mL的石油醚，振荡1min；静置直至上层溶液澄清。重复以上步骤提取2次，将醚溶液合并至棕色圆底烧瓶中，在氮气保护下45 ℃旋转蒸发至干。

取100 mg提取出的油脂于10 mL容量瓶中，加入十七烷酸甘油三酯（C51:0）内标溶液（3 mg/mL） 1 mL，加正己烷定容至刻度。转移溶液至2 mL进样瓶中。

2.2.2 标准溶液的配制

2.2.2.1 标准储备溶液的配制

十七碳酸甘油三酯内标溶液（3 mg/mL）：称取30 mg十七碳酸甘油三酯标准物质，用正己烷溶解并定容至10 mL。

OPO溶液（0.5 mg/mL）：称取25 mg OPO标准物质，用正己烷溶解并定容至50 mL。

2.2.2.2 混合标准工作溶液的配制

准确移取标准储备液十七烷酸甘油三酯内标溶液1 mL和OPO溶液9 mL于10 mL容量瓶中，即为混合标准溶液，其中十七烷酸甘油三酯内标溶液浓度为300 μg/mL，OPO浓度为450 μg/mL。

2.2.3 色谱条件

进样器温度：70 ℃保持1 min，以50 ℃/min速度升温至350 ℃保持25 min；

程序升温：起始温度70 ℃保持1 min，以50℃/min速度升温至170 ℃后，再以20 ℃/min 速度升温至350 ℃，保持25 min；

检测器温度：360 ℃；载气：氦气或氮气，压力约为15 psi；进样量：1.0 μL。

2.2.4 色谱测定

取1.0 μL混合标准工作溶液注入气相色谱仪，在2.2.3色谱条件下测定标准溶液的峰面积响应值，计算出相对响应因子。

取1.0 μL样液注入气相色谱仪，在2.2.3色谱条件下测定试样的峰面积相应值，经过与混合标准工作溶液谱图比较响应值得到试样中OPO的含量。

2.2.5 数据处理

2.2.5.1 计算相对响应因子

式中：

RFi—OPO的相对响应因子；

C51—混标中十七碳酸甘油三酯的浓度，单位为mg/mL；

A51—混标中十七碳酸甘油三酯峰面积；

Aopo—混标中OPO的峰面积；

Copo—混标中OPO的浓度，单位为mg/mL。

2.2.5.2 计算 OPO的含量

式中:

Xi—OPO在脂肪中的含量，单位为g/100g；

RFi—OPO的相对响应因子；

Aopo—样品中OPO的峰面积；

Ac51—样品中加入的内标物十七碳酸甘油三酯峰面积；

Cc51—十七碳酸甘油三酯的浓度，单位为mg/mL；

Vc51—样品中加入十七碳酸甘油三酯的体积，单位为mL；

m —试样脂肪的质量，单位为mg。

2.2.6 精密度与回收率实验

按照2.2.3色谱条件连续进样6次，通过RSD值来分析该仪器分析方法的精密度。分别向样品中添加3个不同水平的OPO标准品，按上述实验过程操作，每个水平重复试验6次，通过RSD值来分析该方法的精密度，计算回收率。

2.2.7 实验室间比对

本实验室与合作实验室对3个不同样品（样品1、2、3）按上述实验过程操作，每个样品重复测定6次检测OPO含量，比较实验室间的结果差异。

3 结果与分析

3.1 色谱柱选择

本研究根据脂肪酸结构性质，选取适合脂肪酸分离的ZB-HT和CP-TAP两种不同色谱柱，按照2.2.3色谱条件对同一样品进行测定，研究两种不同色谱柱针对分离C52系列同分异构体的效果，结果见图1。

图1 两种色谱柱对同一样品针对C52出峰色谱图

图1 显示，ZB-HT无法将碳原子数为52个的脂肪酸有效分离；CP-TAP能够分离出4-5个C52系列同分异构体，可以将OPO从C52系列脂肪酸中分离。

3.2 进样器选择

本研究对进样口的选择进行比较，使用同一型号色谱柱（CP-TAP）对同一标准品进行测定，分别使用普通分流/不分流进样口和多模式进样口（MMI）进行分离，结果见图2。

图2 使用不同进样口对同一标准品出峰色谱图

图2 显示，MMI进样口相对于普通分流/不分流进样口色谱峰峰形更好，MMI进样口在冷不分流模式中，可以将进样口温度冷却至低于样品沸点的温度，在样品进样过程中不会发生汽化，进样口可根据程序加热，使样品汽化，并通过载气将其传送到色谱柱。与普通分流/不分流进样口相比，MMI进样口的主要优点是分析物可以在较低的进样口温度下而不是在恒定的高温下汽化，降低分析物热裂解的可能性。

3.3 色谱条件优化

气相色谱仪中以柱温、升温程序的影响最大，在参考文献及相关资料的基础上[13]，研究最优化升温程序。首先进行了恒温条件(a)试验，以恒温350 ℃保持40 min，结果发现恒温条件不适合OPO的分析，各组分出峰时间长且峰型差，不能得到较好的分离效果。采用一阶升温程序(b)分离，170 ℃保持1 min后以20 ℃/min速度升温至350 ℃保持25 min；相较恒温条件试验，峰型虽然得到改善，但分离效果仍不理想，如图3。采用二阶升温程序(c)进行条件优化，70 ℃保持1 min后以50 ℃/min速度升温至170 ℃，再以20 ℃/min速度升温至350 ℃保持25 min，如图4。

图3 前处理后配方乳粉样品在CP-TAP色谱柱使用(b)程序升温条件的色谱图

图4 前处理后配方乳粉样品在CP-TAP色谱柱使用(c)程序升温条件的色谱图

根据试验结果，逐步进行优化，最后得如下条件：

整个过程耗时37 min，使得配方乳粉中所有脂肪酸全部出峰，且C51与OPO分离效果良好。选择较低的起始温度，使得在程序升温色谱分析时，多组分宽沸程混合物进样后，由于蒸汽压过低，大部分样品溶解在固定相中，随着柱温越来越高，某些组分的蒸汽压便带动样品移动至检测器端，而柱温越来越接近保留温度，色谱带增加的速度越快，从而对少数低沸点组分为最佳柱温，得到良好分离效果[14]。

通过标准品及加标实验可知，图5中出峰时间为19min的是内标，20.8min的是OPO。图5还显示，奶粉样品中的C52系列组分集中在20min至23min之间出峰。通过本实验中的色谱条件，C52系列的色谱峰可以很好的被分离开，并没有重叠信号。这表明本方法适用于婴幼儿配方乳品中OPO含量的测定。通过标准品色谱图中的峰面积值，求得OPO与十七烷酸甘油三酯的相对响应因子RRFTG(OPO)=0.79。

图5 配方乳粉中OPO的色谱图

3.4 精密度与回收率

按本方法的色谱条件对同一样品进行6次试验，计算出OPO的含量后进行精密度分析，结果见表1，RSD值为2.93 %，表明仪器分析方法的重现性良好。

表1 精密度分析

向样品中添加3个不同水平的OPO标准品，按上述实验过程操作，每个水平重复试验6次，结果见表2，回收率为92.4±4.5%。

表2 回收率测定结果

3.5 实验室间比对

按本方法的实验过程操作，同等色谱条件对3个不同样品进行平行测定，计算出OPO的含量后进行实验室间数据比对，所得结果见表3。

表3 不同实验室间数据结果

表3显示，实验室A和B检测结果基本一致，实验室对同一水平检测6次结果的平均值间的相对标准偏差（RSD）<5.0 %，表明方法的重现性良好。

4 结论

本研究采用气相色谱法，建立了奶粉中OPO含量的测定方法，通过有机溶剂提取配方乳品中的脂肪酸，再以C51:0为内标对OPO进行定量。

脂肪酸提取过程采用乙醚石油醚混合多次提取，以保证脂肪酸提取更加充分；MMI进样器适合分析复杂基质的样品，对于分析食品萃取物，可以提高分析灵敏度，最大程度地减少热不稳定样品的分解或降解，消除对一些化合物的针头歧视现象；CP-TAP毛细管柱可以将C52系列脂肪酸分离，相对于其它色谱柱而言分离效果更好。

结果表明，本方法RSD为2.93%，重现性良好，回收率为92.4±4.5%，实验室间比对结果一致，RSD <5.0 %。因此本方法准确可靠，可以对婴幼儿配方乳粉中OPO的含量进行准确测定。

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［12］ 中外专家探讨配方奶粉的重大创新突破 配方奶粉可以变得更易吸收.2010年11月11日14:04. 来源：人民网-健康卫生频道,http://health.people.com.cn/GB/13189069.html.

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