片仔癀对脑梗死大鼠ZO－1、MMP－9蛋白及mRNA表达的影响1）

黄希艳，李 倩，朱陵群

我国每年约有200万新发卒中病例，死于卒中人数约有150万人。在卒中疾病中，缺血性脑卒中占60%～80%［1］，因此探讨缺血性脑卒中发病机制及药物保护问题显得尤为重要。片仔癀方由三七、天然麝香、天然牛黄、蛇胆等天然药材组成［2］。具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的显著功效［3］。本课题为了进一步了解片仔癀在脑缺血后脑保护的作用，探讨其恢复机制，建立大脑中动脉阻塞（MCAO）大鼠模型，给予片仔癀干预，观察其ZO－1、MMP－9蛋白及mRNA表达的变化，为临床治疗提供理论及实践基础。

1 材料与方法

1．1 动物分组 成年SD大鼠35只，雄性，体重260g±20g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证编号：SCXK－（军）2007－004。

大鼠随机分为手术组和假手术组（正常组）。手术组根据术后Longa评分将纳入标准者随机分组，模型组（生理盐水组）、片仔癀大剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀小剂量组脑、得生组、尼莫地平组，每组5只。

1．2 药品与试剂 片仔癀胶囊（漳州片仔癀药业股份有限公司，批号：0711050；）；尼莫地平片（拜耳医药保健有限公司，国药准字：H20003010，产品批号：BJ00604，规格：每片含30mg）；脑得生（广东国医堂制药股份有限公司，批号110101，糖衣片，片芯重0．3，每盒72片）；一抗：MMP－9为羊多克隆抗体（santa cruz，货号：SC－6841）；ZO－1为兔多克隆抗体（santa cruz，货号：SC－1084）；Actin兔多克隆抗体（santa cruz，货号：sc－1616）；二抗：HRP标羊抗兔IgG 二抗（santa cruz，货号：sc－2004）、HRP标兔抗羊IgG 二抗（santacruz，货号：sc－2768）；RNA 抽提试剂盒：尚柏生物医学（北京）有限公司。

1．3 MCAO模型的制备 参考文献［4，5］采用改良 Zea－Longa方法制备。于清醒后2h参照Longa 5级标准［4］对神经功能评分。

1．4 给药方法 按大鼠与人体表面积等效剂量折算，片仔癀实验小剂量、中剂量、大剂量分别设定为每日0．054g／kg、0．162 g／kg、0．486g／kg，脑得生为0．486g／kg，尼莫地平为0．010 8 g／kg。以上各组均于造模前灌胃给药3d，第4天灌胃给药后30min造模，造模后给药观察至第7天，取材。

1．5 标本制备 分别于MCAO术后第3天取各组大鼠5只，经3．5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速断头处死大鼠，立即取右侧梗死区大脑皮层（约120mg），放入冻存管后置于液氮罐中保存，以备行western blot及实时荧光PCR检测。

1．6 MMP－9、ZO－1蛋白测定 每组组织各取20mg左右置入预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨成粉末状，加入1mL总蛋白提取液，冰上裂解20min，离心后取上清液即为总蛋白；BCA法样品蛋白浓度测定后5×buffer缓冲液在100℃沸水中煮沸10min；转膜；5%脱脂奶粉封闭，37℃摇床孵育1h；一抗用含5%脱脂奶粉稀释1∶200，二抗1∶3000；ECL曝光：使用ECL化学发光显色液（SUNBIO）。

1．7 MMP－9、ZO－1mRNA测定 应用总RNA提取试剂盒，用一步法RQ－PCR试剂盒（Promega Corporation）进行检测。ZO－1、MMP－9引物由尚柏生物医学（北京）有限公司使用Primer express 3．0软件设计并合成上下游引物，选用actin作为内参校正样品的RNA含量。

2 结 果

2．1 片仔癀对ZO－1、MMP－9蛋白表达的影响与假手术组相比，模型组ZO－1表达显著降低（P＜0．01），与模型组相比，片仔癀大剂量组、尼莫地平组及脑得生组ZO－1表达显著升高（P＜0．05）；片仔癀大剂量组较片仔癀小剂量组有统计学意义（P＜0．05）。详见表1。

表1 ZO－1蛋白表达的变化（±s）

表1 ZO－1蛋白表达的变化（±s）

与假手术组相比，1）P＜0．01；与模型组相比，2）P＜0．05；与片仔癀小剂量组相比，3）P＜0．05

组别 n ZO－1蛋白假手术组 5 0．344±0．0822）模型组 5 0．170±0．0401）片仔癀大组 5 0．283±0．0112）3）片仔癀中组 5 0．253±0．069片仔癀小组 5 0．240±0．134尼莫地平组 5 0．294±0．1012）脑得生组 5 0．295±0．0782）

1）为国家科技重大专项基金课题（重大新药创制，No：2008ZX09202）

用Western Blot方法检测片仔癀对MCAO大鼠术后MMP－9表达的影响，与假手术组相比，模型组MMP－9表达显著升高（P＜0．01），与模型组相比，片仔癀大剂量组、尼莫地平组及脑得生组MMP－9表达显著降低（P＜0．05）；片仔癀大剂量组较片仔癀小剂量组有统计学意义（P＜0．05）。详见表2。

表2 MMP－9蛋白的表达变化OD值分析（±s）

表2 MMP－9蛋白的表达变化OD值分析（±s）

与假手术组相比，1）P＜0．01；与模型组相比，2）P＜0．05，3）P＜0．01；与片仔癀小剂量组相比，4）P＜0．05

组别 n MMP－9蛋白假手术组5 0．323±0．098模型组 5 0．532±0．0711）片仔癀大组 5 0．394±0．0602）4）片仔癀中组 5 0．477±0．068片仔癀小组 5 0．466±0．084尼莫地平组 5 0．324±0．1583）脑得生组 5 0．380±0．1152）

2．2 片仔癀对ZO－1、MMP－9mRNA表达的影响 用RQ－PCR方法检测片仔癀对 MCAO大鼠术后ZO－1mRNA表达的影响，与假手术组比较，模型组ZO－1mRNA表达显著降低（P＜0．01），与模型组比较，片仔癀大剂量组、中剂量组、尼莫地平组及脑得生组较模型组显著升高（P＜0．01）。详见表3。

表3 ZO－1mRNA表达变化（±s，2－△△Ct）

表3 ZO－1mRNA表达变化（±s，2－△△Ct）

与假手术组相比，1）P＜0．01；与模型组相比，2）P＜0．01

组别 n ZO－1mRNA假手术组5 3．002±0．059模型组 5 1．094±0．0681）片仔癀大组 5 2．696±0．0332）片仔癀中组 5 2．296±0．1352）片仔癀小组 5 1．654±0．074尼莫地平组 5 2．827±0．0192）脑得生组 5 2．538±0．0722）

用RQ－PCR方法检测片仔癀对 MCAO大鼠术后 MMP－9mRNA表达的影响，与假手术比较，模型组 MMP－9mRNA表达显著升高（P＜0．01），与模型组比较，片仔癀大剂量组、中剂量组、小剂量组、尼莫地平组及脑得生组较模型组显著降低（P＜0．05）。详见表4。

表4 MMP－9mRNA表达变化（±s，2－△△Ct）

表4 MMP－9mRNA表达变化（±s，2－△△Ct）

与假手术组相比，1）P＜0．01；与模型组相比，2）P＜0．05

组别 n MMP－9mRNA假手术组5 0．436±0．018模型组 5 0．970±0．0141）片仔癀大组 5 0．680±0．0232）片仔癀中组 5 0．800±0．0343片仔癀小组 5 0．920±0．0302）尼莫地平组 5 0．476±0．0242）脑得生组 5 0．591±0．0182）

3 讨 论

缺血性中风一直是临床上的治疗难题，血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的破坏既是脑缺血损伤的结果，又是进一步导致脑损伤的关键环节［6］，而BBB通透性的改变与紧密连接（tight junction，TJ）的主要成分ZO－1分布及缺失密切相关［7］。同时MMP－9在血脑屏障的损伤中扮演着重要作用［8，9］。在正常状态下，MMP－9被控制在较低水平，不会过度激活。但在缺血性脑损伤发生时，其活性明显增加，促使血脑屏障微血管基膜遭到破坏，导致继发性脑水肿和脑出血等一系列生理病理改变。

片仔癀具有清热解毒、活血祛瘀之功效，运用于治疗缺血性中风取得了很好的疗效。本实验结果提示，片仔癀药物组ZO－1蛋白及mRNA的表达较模型组增高，脑缺血发生后应用片仔癀可上调ZO－1蛋白及mRNA的表达，同时片仔癀药物组MMP－9蛋白及mRNA的表达较模型组下降，脑缺血发生后应用片仔癀可下调MMP－9蛋白及mRNA的表达，这可能是片仔癀促进脑梗死后功能恢复的可能机制之一，可为脑保护剂研制提供新的思路和方法。

［1］ 中华医学会神经病学分会脑血管病学指南撰写组［J］．中国急性缺血性脑卒中诊经科杂志，2010，43（2）：146－153．

［2］ 刘丛盛．片仔癀药理及临床应用综述［J］．医药世界，2006（7）：64－66．

［3］ 徐武英，阎庚飞．片仔癀治疗病毒性肝炎的疗效观察［J］．黑龙江医药，2003，16（6）：542－543．

［4］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomyin rats［J］．Stroke，1989，20（1）：84－91．

［5］ 徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学［M］．第3版．北京：人民卫生出版社，2002：1066－1067．

［6］ Allen CL，Bayraktutan U．Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke［J］．Int J Stroke，2009，4（6）：461－470．

［7］ Jiao H，Wan g Z，Liu Y，et al．Specific role of tight junction proteins Claudin－5，occludin，and ZO－1of the blood brain barrier in a focal cerebral ischemic insult［J］．J Mol Neurosci，2011，4（22）：130－139．

［8］ 毛玲，查运红，梅元武．基质金属蛋白酶－9与脑缺血血脑屏障损伤的关系［J］．国际神经病学神经外科学杂志，2006，33（1）：96－98．

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