硅烷偶联剂制备及对磷灰石-硅灰石生物玻璃陶瓷的表面改性

龙 沁 周大利 张 翔 卫冬娟 柳淑婧 陈冬宁

(四川大学材料科学与工程学院，成都 610064)

0 引 言

磷灰石-硅灰石生物玻璃陶瓷(Apatitewollastonite bioactive glass ceramic，A-W GC) 虽具有较好的力学性能和生物活性，但与羟基磷灰石材料类似，其表面由于不具有作为生物信号的官能团，不能与细胞产生良好的相互作用[1]。氨基酸是组成蛋白质等生物大分子的基本结构单元，谷氨酸是一种酸性氨基酸，分子内含两个羧基，在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。众多研究表明，骨组织工程材料的表面特性能直接影响到材料的生物相容性，人工合成的骨组织工程材料绝大多数亲水性较强，利于细胞黏附，但细胞在材料表面生长，需吸附蛋白质，这又要求材料具有一定的疏水性，因此需借助材料表面改性及表面修饰技术，引入一定基团，调整材料表面亲/疏水平衡值以满足细胞黏附及生长的需要。比如在材料表面固定某些蛋白质或活性因子，提高材料与细胞间相互作用，使细胞更好地在材料表面黏附，进而促进细胞的增殖和分化[2-6]。目前广泛使用的材料表面修饰法有物理包被法、化学改性法、等离子体法等方法。其中，化学改性法是通过化学键固定活性因子，这种方法比物理包被法可靠，但过程较为复杂。共价固定法是化学改性法中的一种类型，其以双官能交联剂(如硅烷偶联剂)为中介，交联剂的一端通过硅醚键连接至材料表面，另一端结合活性因子。

目前利用硅烷偶联剂将氨基酸结合在A-W GC表面的研究少见于文献资料。本研究是通过制备一种含酰胺基的硅烷偶联剂，利用其与无机材料之间的化学反应使氨基酸固定在材料上；考察材料的改性效果，探究氨基酸的附载对材料表面上细胞黏附及生长的影响，为今后的多肽和蛋白质对材料表面细胞黏附及生长影响的研究奠定一定基础。

1 实验部分

N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-792)具有可水解基团Si-OCH3，水解时转化成Si-OH，可与被处理的无机材料表面的Si-OH发生缩合脱水反应形成Si-O-Si键。另一方面，KH-792与氨基酸发生氨羧缩合反应形成酰胺基。即通过KH-792的双官能团，将氨基酸接枝至A-W GC表面。

1.1 硅烷偶联剂的制备

氨基与羧基缩合脱水生成酰胺的反应是可逆反应，加入缩合剂除去反应生成的水可加快反应速度且提高产率，实验用N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)作为缩合剂进行反应。

按照一定的物质的量比分别称取KH-792，谷氨酸和DCC。首先将前两者加入三颈瓶中，适量的四氢呋喃作为溶剂，磁力搅拌。将三颈瓶置于冰盐浴中，温度降至0℃时加入DCC，反应20 h后，减压过滤，除去沉淀，溶液转至蒸馏瓶中，在0.03 MPa下减压蒸馏，获得粗产物。用二氯甲烷和四氢呋喃溶解粗产物，石油醚重结晶得产品。

1.2 A-W GC的制备

本研究中硅源为正硅酸乙酯(TEOS)，磷源为磷酸三乙酯(TEP)，采用溶胶-凝胶法和煅烧法制备AW GC，制备流程如图1所示[7-8]。

1.3 表面改性实验

取适量乙醇-水(物质的量比9∶1)溶液，磁力搅拌，加入含酰胺基的硅烷偶联剂，水解5 min，再加入A-W GC粉末，30 min后移入烘箱，80℃烘干，取出并用蒸馏水洗至中性，相同温度烘干24 h。干燥后的粉末每样称取0.3 g，20 kN压力下压制成直径为12 mm的圆片，细胞实验待用。

1.4 细胞实验

1.4.1 MTT实验

将第五代人骨肉瘤细胞MG63置于96孔板中，每孔10 000个。加入上述材料样品，细胞培养箱中分别培养1 d，3 d，5 d。孵化结束前5 h，每孔中加入10μL噻唑蓝(MTT)溶液，37℃培养4 h。移除培养基，所有孔中各加入100μL二甲亚砜(DMSO)。孵化箱中培养5 min，消除气泡。在490 nm处测试溶液吸光度。

1.4.2 材料表面细胞固定

将材料样品放入24孔板中，加入1 mL含血清的培养基(DMEM)，在细胞培养箱中孵育过夜。对MG63细胞进行消化，加入培养液制成细胞悬液，采用血球计数板计数法进行计数，将其稀释到20 000 mL-1。将上述材料的DMEM吸掉，加入稀释的MG63细胞悬液900μL，细胞培养箱中培养3 d，每24 h更换一次培养液。取培养3 d的材料/细胞复合物，PBS洗3次后，用2．5%戊二醛在4℃下固定过夜，30%～100%的乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换，CO2超临界干燥，表面喷金，SEM观察。

1.5 统计分析

统计学处理结果使用(Means±SD)表示，分析的结果进行了 Bonferroni方法检测，p＜0．05具有统计意义。

2 结果与讨论

2.1 A-W GC的晶相结构

根据文献[8]，从XRD图(图2)中可看出，在1 200℃烧成的A-W GC中，磷灰石和硅灰石的衍射峰出现，且较尖锐，伴随着有二氧化硅和镁黄长石生成。

2.1 谷氨酸与KH-792的反应

谷氨酸在有机溶剂中溶解度很小，而KH792和DCC易溶，即反应属于液固反应。DCC对应产生的1,3-二环己基脲(DCU)难溶于有机溶剂，减压过滤即可分离。根据氨基和羧基的缩合反应原理，谷氨酸和KH792的物质的量比为1∶2，调整DCC的用量，通过条件实验及结合红外光谱分析，确认当DCC与谷氨酸用量物质的量比为0．9∶1时，能获得含酰胺基的硅烷偶联剂，如图3所示。

由图3知，在2 930 cm-1的峰为-CH2的C-H振动峰，3 260 cm-1附近的峰为-NH的伸缩振动峰，同时在1 630 cm-1附近出现C=O的较强而尖锐的峰，在1 400 cm-1附近出现-CN和-NH的混合峰，强度较弱，故确认产物中有酰胺基生成。谱图中未出现DCC在2 120 cm-1的特征吸收峰，也未出现DCU在3 327 cm-1的一个强而窄吸收峰，即产物中几乎没有DCC和DCU残留。

2.2 硅烷偶联剂对A-W GC表面改性

采用合成的硅烷偶联剂对A-W GC进行表面改性，其用量分别为A-W GC质量的8%和10%，改性前后的红外光谱图如图 4所示，(a)，(b)，(c)分别代表A-W GC，8wt%硅烷偶联剂改性AW-GC，10wt%硅烷偶联剂改性AW-GC的红外光谱。

图中，表面改性后的A-W GC在2 930 cm-1附近出现-CH2的 C-H 振动峰，1 650 cm-1，1 458 cm-1出现酰胺的特征峰；Si-O和Si-O-Si在1 041 cm-1的特征峰变宽且红移至 1 033 cm-1附近，941 cm-1的特征峰消失，可能是硅烷偶联剂与材料表面形成R-Si-O-Si，与材料本身的Si-O-Si振动吸收带重合所致，即硅烷偶联剂对A-W GC进行了表面修饰[9]。后续实验中硅烷偶联剂用量均为A-W GC质量的8wt%。

将表面改性后的A-W GC进行XPS分析。A-W GC为CaO-MgO-SiO2-P2O5-CaF2系统。从XPS图谱分析(图5)可知，改性后的A-W GC材料表面出现了氮元素和碳元素，但未出现磷元素，镁元素和氟元素。对其中的氮元素和氧元素的峰进行拟合处理，如图6(a)和 5(b)。

从图6(a)中可推出，氮元素主要是以-NH基团(399.13 eV)和-NH2基团(400.00 eV)形式存在，即合成的硅烷偶联剂中含酰胺基团和少量未反应的KH-792中的伯胺基存在。图6(b)中，530.4 eV处为-CH(NH2)COOH特征峰，529.40 eV处为Ca-O特征峰，532.4 eV处为Si-O的特征峰，531.5 eV处为-C(O)NH2特征峰。由此可知，A-W GC的表面被合成硅烷偶联剂所覆盖且两者已结合[10]。

2.3 表面改性后材料的体外细胞相容性实验

MTT实验结果如图7所示。从图中可知，细胞数量随时间增长而迅速增加。相对于纯的A-W GC和采用KH-792表面改性的A-W GC(硅烷偶联剂用量为8wt%)，使用合成硅烷偶联剂改性后的A-W GC与MG63细胞复合培养，更有利于细胞MG63在材料表面的粘附和增殖。且通过Bonferroni方法进行检验，结果显示表面改性后A-W GC实验组与未改性的A-WGC对照之间有显著差异(p＜0.05)，可以得知，改性后A-WGC材料对MG63细胞的生长具有良好的促进作用。

将改性后的A-W GC与MG63细胞复合培养3 d，其扫描电镜结果如图8所示。从图8可知，细胞牢固地粘附于改性A-W GC较平整表面上，呈多边形及梭形，细胞充分铺展生长，向四周伸出伪足与较粗糙的A-WGC表面颗粒相连，分泌的细胞外基质包绕于细胞周围。说明含酰胺基的硅烷偶联剂改性后的A-W GC具有良好的细胞相容性。

据文献[11-15]报道，从材料的表面电荷分析，哺乳动物细胞膜表面荷负电，荷正电的材料表面与荷负电的细胞由于静电吸附而利于细胞黏附，荷负电的材料表面与荷负电的细胞由于静电排斥，不利于细胞黏附。本研究通过固定含有丰富正电荷基团的谷氨酸在材料表面，提高了材料的表面电荷浓度，增加了黏附细胞的数量，也增强了细胞的黏附力。其次，材料表面的化学基团也是影响细胞黏附生长的重要因素，羧基、磺酸基、氨基、亚氨基及酰胺基等基团有利于细胞的黏附。含氮基团不仅能使材料表面带一定的正电荷，调节其亲水/疏水平衡，也可与蛋白质肽链发生官能团间的相互作用，促进细胞黏附。通过表面改性在A-W GC的表面引入了上述基团，起到了一定作用。

3 结 论

(1)利用氨基和羧基的缩合反应制备出了一种含酰胺基的硅烷偶联剂，应用于A-WGC的表面改性；

(2)表面改性后的A-W GC其表面电荷及表面基团利于细胞在材料表面的黏附和增殖，提高了AW GC的细胞相容性，达到了改性修饰的目的；

进一步研究工作设想：将进行不同氨基酸固接在A-W GC上进行动物体内植入试验研究；研究二肽、多肽或蛋白质在A-W GC表面上的结合及对材料的生物相容性影响。

[1]Yang C L,Cheng K,Weng W J,et al.J.Mater.Sci.:Mater.Med.,2009,20(11):2349-2352

[2]Mathews D T,Birney Y A,Cahill P A,et al.J.Biomed.Mater.Res.Part B:App.Biomate.,2008,84(2):531-540

[3]Feng Y K,Guo JT.Int.J.Mol.Sci.,2009,10(2):589-61

[4]Williams D F.Biomaterials,2008,29(20):2941-2953

[5]Silveira A C C,Lima R S,Penha E M,et al.Veterinary Immunol.Immunopathol.,2009,128(1-3):342

[6]Feng Q,Chow P K,Frassoni F,et al.Exp.Hematol.,2008,36(11):1556-1566

[7]LI Guang-Da(李光大)，ZHOU Da-Li(周大利),FENG Dan-Ge(冯丹歌),et al.J.Inorg.Mater.(Wuji Cailiao Xuebao),2008,23(3):621-625

[8]XUE Ming(薛明),FENG Dan-Ge(冯丹歌),LI Guang-Da(李光大),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2007,23(4):708-712

[9]YAO Hui-Mei(姚辉梅),SANG Tai-You(商太友),MENG Xiang(孟祥),et al.Guangzhou Chem.Ind.(Guangzhou Huagong),2011,39(22):61-62

[10]LIAO Jian-Guo(廖建国),WANG Xue-Jiang(王学江),ZUO Yi(左奕),et al.J.Inorg.Mater.(Wuji Cailiao Xuebao),2008,23(1):145-149

[11]Shelton R M,Rasmussen A C,Davies J E.Biomaterials,1988,9(1):24-29

[12]Massia S P,Hubbell J A.J.Biol.Chem.,1992,267(14):10133-10141

[13]Tamada Y,Ikada Y.J.Biomed.Mater.Res.,1994,28(7):783-789

[14]Lee J H,Jung H W,Kang I K,et al.Biomaterials,1994,15(9):705-711

[15]Cook A D,Hrkach J S,Gao N N,et al.J.Biomed.Mater.Res.,1997,35(4):513-523

[16]FENG Dan-Ge(冯丹歌),ZHOU Da-Li(周大利),LONG Qin(龙沁),et al.Chin.J.Tissue Engi.Res.(Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Yu Linchuang Kangfu),2009,13(12):2253-2256

[17]LIU Gang(刘刚).Thesis for the Doctorate of the Fourth Military Medical University(第四军医大学博士论文).2003.

[18]LUO Chun-Hua(罗春华),DONG Qiu-Jing(董秋静),CAO Jian(曹 健 )，et al.J.Fuyang Teachers College:Nat.Sci.(Fuyang Shifan Xueyuan Xuebao:Ziran Kexue Ban),2010,27(1):1-4

[19]WANG Wei-Chen(王 伟 宸 )，LIU Wei(刘 伟 ).J.Beijing Univ.Chem.Technol.:Nat.Sci.(Beijing Huagong Daxue Xuebao:Ziran Kexue Ban),2010,37(2):16-20

[20]LI Mu-Qin(李慕勤),GUAN Da-Wei(管大为),WANG Jing-Yan(王晶彦),et al.J.Ceram.(Taoci Xuebao),2008,29(4):344-347

[21]LI Xian-Xue(李先学)，SHEN Gao-Yang(沈高扬),YANGLei(杨磊),et al.Chin.J.Rare Metals(Zhongguo Xitu Xuebao),2011,35(4):613-616

[22]JI Xiao-Li(吉晓莉),ZHENG Cai-Hua(郑彩华),WEI Lei(魏磊),et al.Chem.Bioengin.(Huaxue Yu Shengwu Gongcheng),2008,25(1):21-23