制备高效液相色谱法分离纯化大黄酚和大黄素甲醚

田嘉铭， 饶 娜， 信秀玲， 王书华

(河北北方学院药学系，河北张家口075000)

大黄酚和大黄素甲醚为蓼科植物大黄中的两种有效成分单体，属蒽醌类化合物，大黄酚具有止咳、抗菌、止血、降血糖、收缩血管、降低血管脆性的作用，能消除体内自由基，有明显的抗衰老和促进学习记忆的作用［1-4］，大黄素甲醚对大肠杆菌等26种细菌有抑制作用，对人体宫颈癌Hela细胞生长具有较强的抑制作用［5］。

在植物体内，大黄酚和大黄素甲醚常共同存在，结构见图1。

图1 大黄酚和大黄素甲醚结构图

两种化合物结构相似，酸性与极性相近，使分离工作极为困难。大黄酚、大黄素甲醚的分离纯化方法有柱色谱法、薄层色谱法、高效毛细管电泳法等，但操作繁琐、制备量低。

制备高效液相色谱 (PHPLC)法已成为当今高效分离与纯化中药有效成分的重要技术手段，在制备高纯度生物活性物质时，操作简单，制备量大［6］，而用PHPLC分离纯化大黄酚和大黄素甲醚的研究尚未见报道。本实验建立了PHPLC分离、纯化大黄中大黄酚和大黄素甲醚的分析方法，为大黄酚和大黄素甲醚的实验室大规模制备提供了实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 大黄购于张家口市张垣中药饮片有限公司，甘肃，批号为090801;大黄酚对照品，批号为110796-200310，大黄素甲醚对照品，批号为0758-9803，中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Agilent 1100 HPLC(美国安捷伦公司);Agilent1200 Preparative HPLC(美国安捷伦公司);MODUL YOD-230真空冷冻干燥系统 (美国热电公司);ME-SE Series电子天平 (德国赛多利斯公司);SGW X-4显微熔点仪(上海精密科学仪器有限公司);U-3900紫外可见分光光度计 (日本日立公司);BRUKER AVANCE-400兆液体谱仪(德国布鲁克公司);LD-04高速中药粉碎机 (浙江省温岭市大海药材机械厂)。

2 方法与结果

2.1 大黄中大黄酚和大黄素甲醚粗产品的提取 按文献［7］并改进，称取干燥粉碎的大黄粉末 (过60目筛)400.0 g置于2 L圆底烧瓶中，加入适量的石油醚，常压恒温 (62～63℃)回流1 h，趁热过滤，滤渣真空干燥(50℃，0.08 MPa)。称真空干燥的大黄粉末200.0 g，加15%的硫酸溶液400 mL，搅拌均匀，密封5 d，加入三氯甲烷1 000 mL回流提取2次，每次3 h(温度61.7～63.0℃)，稍冷后抽滤，弃去残渣，将三氯甲烷提取液转入分液漏斗中，用蒸馏水洗涤三氯甲烷提取液。将三氯甲烷提取液置于1 000 mL分液漏斗中，用5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、5%氢氧化钠依次萃取，直至三氯甲烷溶液的颜色变为黄色 (除去大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等)。将含有大黄酚和大黄素甲醚的三氯甲烷溶液减压浓缩 (42～43℃，0.08 MPa)至200 m L，用5%氢氧化钠溶液反复萃取三氯甲烷溶液中的大黄酚和大黄素甲醚，同时用高效液相色谱法定量，跟踪检测大黄酚和大黄素甲醚的萃取过程。合并几次萃取的5%氢氧化钠溶液，滴加盐酸至pH值为3，减压浓缩该溶液至有沉淀析出，抽滤，用蒸馏水洗涤沉淀，低温高速离心 (1 000 r/min，8 min)，用AgNO3随时监测上清液中的氯离子，直至氯离子消失。沉淀物自然干燥得大黄酚和大黄素甲醚混合物粗品。

2.2 HPLC法测定大黄酚和大黄素甲醚［8-9］

2.2.1 色谱条件 Hypersil ODS2色谱柱 (4.6 mm×150 mm，5.0μm)，柱温35℃，进样量20μL，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液 (85∶15)，体积流量1 mL/min，检测波长254 nm。

2.2.2 标准曲线的制作 精密称取大黄酚、大黄素甲醚对照品1.0 mg，甲醇溶解、定容，配成0.10 mg/mL的标准溶液。吸取标准溶液分别配成质量浓度为1.0、5.0、10.0、15．0、20.0μg/mL的标准溶液，按色谱条件进样，以质量浓度对峰面积进行线性回归，得标准曲线方程为:大黄酚Y=3.431X－3.987，r=0.999 8，线性范围为1.0～20.0 μg/mL。大黄素甲醚:Y=1.703X+11．839，r=0.999 6，线性范围为1.0～20.0μg/mL。

2.2.3 供试品的定量测定 采用外标法。按2.2.1项色谱条件测定，将大黄酚和大黄素甲醚峰面积代入标准曲线方程，得大黄酚和大黄素甲醚质量浓度，计算含有量。

2.3 PHPLC分离纯化大黄酚和大黄素甲醚

2.3.1 检测波长的选择 大黄酚、大黄素甲醚对照品，甲醇溶解，经U-3900紫外分光光度计在200～450 nm扫描，结果大黄酚、大黄素甲醚均在254 nm有吸收，且灵敏度较高。因此，选择254 nm为检测波长。

2.3.2 制备液相色谱条件 色谱柱为ZORBAX SB-C18(21.2 mm×250 mm，7μm)，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液 (85∶15)，柱温30℃，进样量8 mL，体积流量20 mL/min，检测波长254 nm，基于峰进行馏分收集，最小阈值为2.0 mAU。

2.3.3 制备大黄酚和大黄素甲醚 用适量流动相溶解2.1项的大黄酚与大黄素甲醚粗品，过0.45μm微孔滤膜。按制备色谱条件进样，根据制备色谱图收集大黄酚与大黄素甲醚馏分，馏分经减压浓缩，至有少量晶体析出时，真空冷冻干燥，得大黄酚1.780 2 g，大黄素甲醚0.980 2 g。见图2。

2.4 制备所得大黄酚和大黄素甲醚纯度检测 对照品定性，见图3、4，将制备所得大黄酚和大黄素甲醚按2.2.1项色谱条件下进行定量测定，采用峰面积归一化法，大黄酚的纯度为98.1%(杂质峰面积为25.7，大黄酚峰面积为1 323)，外标法定量，测得大黄酚质量分数为98.8%(n=3)，大黄素甲醚的纯度为98.3%(杂质峰面积之和为19.3，大黄素甲醚峰面积为1 149.8)，外标法定量，测得大黄素甲醚质量分数为98.7%(n=3)。

图2 大黄酚和大黄素甲醚制备液相色谱图

图3 大黄酚HPLC图

2.5 大黄酚和大黄素甲醚结构鉴定

所得单体大黄酚为黄色晶体，熔点仪未校正，mp 184～185℃，与对照品混合熔点不下降。1H-NMR进行结构鉴定，1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.17(1H，s， － OH)，12.07(1H，s， － OH)，7.87(1H，d，C5-H)，7.72(1H，dd，C6-H)，7.70(1H，s，C4-H)，7.32(1H，dd，C7-H)，7.15(1H，s，C2-H)，2.51(3H，s，Ar-CH3)。数据与文献［10］报道一致。

所得单体大黄素甲醚为橙红色晶体，熔点仪未校正，mp 203～204℃，与对照品混合熔点不下降。1H-NMR进行结构鉴定，结果为:1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.30(1H，s， － OH)，12.29(1H，s， － OH)，7.35(1H，d，C5-H)，7.58(1H，d，C4-H)，7.69(1H，d，C7-H)，7.05(1H，s，C2-H)，3.96(3H，s，OCH3)，2.46(3H，s，Ar－CH3)。数据与文献 ［11］报道一致。

图4 大黄素甲醚HPLC图

3 讨论

3.1 提取条件的选择 按文献［7］提取时，提取物冷冻干燥时总会有油状物存在，干燥不完全，考虑可能是挥发油类物质，经查文献，大黄酚和大黄素甲醚在石油醚中几乎不溶，为此我们选择先用石油醚对大黄进行脱脂处理，在用5%氢氧化钠萃取大黄酚和大黄素甲醚过程中，先对三氯甲烷溶液减压浓缩，节省了氢氧化钠的使用量，同时采用HPLC实时检测大黄酚和大黄素甲醚的萃取过程，比文献［7］中报道的单纯靠颜色判断萃取过程更加准确可靠。

3.2 流动相和体积流量的选择 大黄酚和大黄素甲醚均具有一定的极性和酸性，考察了不同比例的甲醇-1%醋酸，乙腈-1%醋酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸对分离效果的影响，结果表明，同一条件下甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)作为流动相时，大黄酚和大黄素甲醚可以达到基线分离，出峰时间短 (20 min)。在流动相选定的条件下，考察了不同体积流量 (10～25 mL/min)对分离大黄酚和大黄素甲醚的影响，当体积流量小于20 m L/min时，虽然大黄酚和大黄素甲醚能很好的分离，但保留时间延长，所需流动相的量增加，造成试剂的浪费;而增大体积流量虽然能够缩短保留时间，但体积流量大于20 mL/min时，大黄酚和大黄素甲醚分离效果不佳，本实验选择体积流量为20 mL/min。

3.3 进样量的选择 在样品质量浓度一定条件下，考察了不同进样体积(4～10 mL)对大黄酚和大黄素甲醚分离度的影响。实验结果表明，小于8 mL进样体积范围内，分离度较好，但流动相用量太大，造成浪费;进样体积大于8 mL时，大黄酚和大黄素甲醚重叠严重，无法选取合适的馏分收集位置，使产品纯度无法保证。当进样量为8 mL时，保证了流出曲线的峰对称性。因此，本实验选择进样量为8 mL。

与薄层色谱法、高效毛细管电泳法［12-13］相比较，应用PHPLC法分离制备大黄酚和大黄素甲醚，进样量大，出峰时间短，样品纯度高、操作简便，可用于实验室大规模制取大黄酚和大黄素甲醚对照品。

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