密骨打老儿丸对去卵巢大鼠骨质疏松的影响

2013-09-14武密山赵素芝任立中韩红伟

中成药 2013年1期

武密山，赵素芝，任立中，王茹，白霞，韩红伟，李彬

(1.河北医科大学中医学院方剂学教研室，河北石家庄050091;2.石家庄市桥东区医院，河北石家庄050041;3.河北医科大学第一医院骨科，河北石家庄050031;4.河北医科大学生物化学教研室，河北石家庄050017)

骨质疏松症 (Osteoporosis)是以骨量减少、骨组织显微结构退化 (松质骨骨小梁变细、断裂、数量减少，皮质骨多孔、变薄)为特征，以致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身骨病。本课题组前期研究表明，由淫羊藿、骨碎补、菟丝子、补骨脂等组成的补肾方药在抑制骨丢失，改善骨密度，增强骨生物力学抗压性能方面有明显疗效［1-7］。打老儿丸来源于《万氏家抄方·卷四》，功用滋阴补阳，强壮筋骨，主治五劳七伤，阳事不举，真气衰弱，精神短少，小便无度，眼目昏花，腰膝疼痛，两脚麻冷，不能行走。本实验将课题组前期研究成果与打老儿丸配伍组成密骨打老儿丸，采取切除卵巢建立骨质疏松模型，用骨组织形态计量学、骨生物力学等方法探讨密骨打老儿丸防治去卵巢骨质疏松大鼠骨丢失和骨质量下降的作用及机理。

1 材料与仪器

1.1 动物 3月龄SPF级雌性SD大鼠共60只，体质量 (265±15)g，实验动物由河北省实验动物中心提供［许可证号:SCXK(冀)2003-1-003］。

1.2 仪器与试剂慢速锯 (美国 Buehler公司产品);硬组织切片机及钨刚刀 (德国Leica公司产品);NGS—10KNG电子万能精密材料试验机(日本岛津公司产品);自动化图像数字化分析仪包括光镜和荧光显微镜 (日本 Nikon公司产品);Labconco冰冻真空干燥仪 (法国 LEGO公司产品);960型荧光分光光度计、AE100电子天平(中国伯乐公司产品);火焰原子吸收分光光度计(日本岛津公司产品);J2—SH高速冰冻离心机(中国杭州华亭公司产品);Lunar—XR型双能X线骨密度测定仪 (美国Lunar公司产品);ALCYON 300i型全自动生化仪 (美国Abbott Laboratories公司产品);D—800 LS智能药物溶出仪 (天津大学无线电公司产品);大鼠代谢笼 (意大利TECN IPLAST公司产品);盐酸四环素及钙黄绿素 (美国Sigma公司产品);17β-雌二醇 (Sigma公司产品)，钙、磷试剂盒、肌酐试剂盒、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒 (中生北控生物科技股份有限公司产品);脱氧吡啶酚ELISA试剂盒 (美国Quidel Corporation公司产品)。

1.3 中药制备打老儿丸来源于《万氏家抄方·卷四》，组成为石菖蒲、干山药、川牛膝、远志、巴戟天、川续断、五味子、楮实子、杜仲、山萸肉、茯神、熟地黄、小茴香、肉苁蓉、枸杞子各等份。打老儿丸加上本课题组的前期成果［1，4-6］淫羊藿、骨碎补、菟丝子、补骨脂各等份组成密骨打老儿丸。饮片一次性购自石家庄市乐仁堂，按处方配伍后，加8倍量水，共同浸泡40min，煮沸后文火煎煮60 min，滤出药液;药渣加2倍水量继续煎煮40 min，合并两次滤液，水浴浓缩，每1 mL药液含生药5.5 g，相当于临床用量的20倍。高剂量密骨打老儿丸灌胃剂量为5 mL/kg，低剂量密骨打老儿丸灌胃剂量为2.5 mL/kg。

2 方法

2.1 实验造模与分组健康3月龄SD雌性大鼠60只，随机分为假手术组、模型组、雌二醇组、密骨打老儿丸低剂量组、密骨打老儿丸高剂量组，每组12只。将动物乙醚麻醉，腰背部两侧剪毛，75%乙醇消毒，假手术组大鼠背部切口，找到卵巢后，只切除少量脂肪组织后缝合;其他各组均参照本实验室的背驮式方法［5］从背侧切口摘除双侧卵巢，缝合伤口，然后涂以红霉素软膏抗感染，于卵巢切除1周后，给大鼠灌胃给药。密骨打老儿丸低剂量组大鼠灌胃给予2.5 mL/kg密骨打老儿丸混悬液，密骨打老儿丸高剂量组大鼠灌胃给予5 mL/kg密骨打老儿丸混悬液，雌二醇组灌胃给予2 mg/kg雌二醇混悬液，假手术组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水，每周记录体质量变化，连续给药3个月。所有大鼠在处死前第4、第3天和第14、第13天分别皮下注射盐酸四环素30mg/kg和钙黄绿素5 mg/kg进行荧光标记，实验结束前1 d，收集大鼠24 h尿液，腹主动脉取血，然后处死动物，取出大鼠的第2、第4腰椎、胫骨和股骨，剔净附着的软组织和软骨。

2.2 骨密度 (BMD)测定取右侧股骨，按文献［9］分别测出股骨整体、股骨近端 (为股骨近侧干骺端1/3)，股骨远端 (为股骨远侧干骺端1/4)骨密度，最终以平均值计。

2.3 骨钙 (b-Ca)、骨磷 (b-P)测定取第2腰椎用10% 三氯醋酸3 mL脱钙3次，每次24h，合并脱钙液，取适量，用 EDTA法测钙，计算单位骨体积的含钙量;用硫酸亚铁法测磷，计算单位骨体积的含磷量。

2.4 尿钙 (u-Ca)、尿磷 (u-P)、尿脱氧吡啶酚(D-Pyr)和肌酐 (Cr)检测实验结束前1 d，用大鼠代谢笼收集大鼠 24 h尿液，记录尿量。用ELISA法测定尿中脱氧吡啶酚的量，用全自动生化分析仪测定尿中钙、磷和肌酐的量。

2.5 血钙 (s-Ca)、血磷 (s-P)和血清碱性磷酸酶 (ALP)分析大鼠用乙醚麻醉后，腹主动脉取血，离心，分离血清，用全自动生化分析仪测定血清中钙、磷和碱性磷酸酶的活性。

2.6 子宫取出大鼠的子宫，迅速称质量，计算子宫脏器系数。

2.7 骨组织形态计量学静态参数和动态参数的测定大鼠处死后取左侧胫骨，用慢速锯沿额状面锯开胫骨粗隆，暴露骨髓腔，于胫骨近心端1/3处横行锯断胫骨，即为胫骨上段。取胫骨上段按文献［8］进行固定、脱水、包埋、切片，然后测量静态参数骨组织总面积、骨小梁面积、骨小梁周长和动态参数单标记周长、双标记周长、双标记间距，最后按公式［9］计算出相应的静态参数骨小梁厚度和动态参数标记周长百分数、骨形成率 (BFR/BV为每年新形成的骨小梁面积占骨小梁总面积的百分比，代表骨形成和骨转换的活跃程度，此参数越高，表示骨转换越亢进;BFR/TV为每年新形成的骨小梁面积占骨组织面积的百分比，代表每年骨小梁表面新形成骨的总量)。

2.8 腰椎生物力学参数的测定取第4腰椎，去除棘突和关节突，把两端面磨平且与轴线垂直，根据浮力原理，测定腰椎体积，其体积和椎体高的比值作为椎体平均横截面积，按文献［12］进行椎体压缩试验，然后计算出生物力学参数弹性载荷 (N)、最大载荷 (N)、断裂载荷 (N)、刚度 (N/mm)。

3 结果

3.1 对骨密度 (BMD)，骨钙 (b-Ca)、骨磷 (b-P)的影响见表 1。与假手术组比较，模型组BMD、b-Ca、b-P明显降低 (P＜0.01)。与模型组相比，密骨打老儿丸高剂量组、密骨打老儿丸低剂量组、雌二醇组 BMD、b-Ca、b-P显著增加 (P＜0.01)。

表1 对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度、骨钙、骨磷的影响( ± s，n=12)Tab.1 Effects of M igu Dalao'er Pills on BMD in thighbone and calcium phosphorus in the second lum bar vertebra of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲▲P＜0.01。

组别骨密度/(g·cm －2)第2腰椎b-Ca/(mg·cm－3) b-P/(mg·cm－3)假手术组0.198±0.017 0.365±0.013 0.134±0.003模型组 0.161±0.016＊＊ 0.327±0.015＊＊ 0.122±0.005＊＊密骨打老儿丸低剂量组 0.185±0.019▲▲ 0.348±0.023▲▲ 0.131±0.007▲▲密骨打老儿丸高剂量组 0.191±0.017▲▲ 0.357±0.025▲▲ 0.132±0.008▲▲雌二醇组 0.192±0.018▲▲ 0.358±0.024▲▲ 0.133±0.006▲▲

3.2 对尿钙 (u-Ca)、尿磷 (u-P)和尿脱氧吡啶酚/尿肌酐 (D-Pyr/Cr)的影响见表2。与假手术组比较，模型组u-Ca、D-Pyr/Cr显著增加 (P＜0.01)，u-P无明显变化 (P＞0.05)。与模型组相比，密骨打老儿丸高剂量组、密骨打老儿丸低剂量组、雌二醇组u-Ca、D-Pyr/Cr显著减少 (P＜0.01)，u-P无明显变化 (P＞0.05)。

表2 对去卵巢骨质疏松大鼠尿钙、尿磷和尿脱氧吡啶酚/尿肌酐的影响( ± s，n=12)Tab.2 Effects of M igu Dalao'er Pills on D-Pyr/Cr and calcium phosphorus in the urine of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲▲P＜0.01。

组别 (D-Pyr/Cr)/(mmol·mg－1) 尿液u-Ca/(mg·mg－1) u-P/(mg·mg－1)假手术组4.81±0.62 0.82±0.14 1.84±0.16模型组 8.65±0.71＊＊ 1.34±0.17＊＊ 1.71±0.18密骨打老儿丸低剂量组 5.95±0.79▲▲ 0.92±0.16▲▲ 1.76±0.18密骨打老儿丸高剂量组 5.26±0.73▲▲ 0.85±0.19▲▲ 1.78±0.16雌二醇组 5.32±0.78▲▲ 0.84±0.21▲▲1.77±0.17

3.3 对血钙 (s-Ca)、血磷 (s-P)、血清碱性磷酸酶 (ALP)和子宫脏器系数的影响见表3。与假手术组比较，模型组血清 ALP显著增加 (P＜0.01)，子宫脏器系数降低 (P＜0.01)，s-Ca、s-P无明显变化 (P＞0.05)。与模型组相比，密骨打老儿丸高剂量组、密骨打老儿丸低剂量组、雌二醇组ALP活性显著降低 (P＜0.01)，雌二醇组的子宫脏器系数升高 (P＜0.01)，各组 s-Ca、s-P无明显变化 (P＞0.05)。

表3 对去卵巢骨质疏松大鼠血钙、血磷、血清碱性磷酸酶和子宫脏器系数的影响( ± s，n=12)Tab.3 Effects of M igu Dalao'er Pills on ALP and calcium phosphorus in the serum and uterus/body weight of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲▲P＜0.01。

组别 (子宫/体质量)/(mg·g－1) ALP/(U·L－1) 血清s-Ca/(mg·L －1) s-P/(mg·L －1)假手术组1.85±0.11 74.12±9．65 11.02±0.21 3.08±0.13模型组 0.41±0.08＊＊ 99.23±8．53＊＊ 10.36±0.19 3.15±0.16密骨打老儿丸低剂量组 0.45±0.07＊＊ 78.28±10．13▲▲ 10.42±0.17 3.12±0.17密骨打老儿丸高剂量组 0.43±0.05＊＊ 75.25±9．14▲▲ 10.65±0.15 3.10±0.14雌二醇组 1.13±0.06▲▲ 74.52±10．26▲▲10.54±0.20 3.09±0.16

3.4 对胫骨上段骨组织计量学参数的影响

3.4.1 对胫骨上段骨组织计量学静态参数的影响见表4。与假手术组比较，模型组骨组织总面积、骨小梁面积、骨小梁周长显著降低 (P＜0.01)，骨小梁厚度无明显变化 (P＞0.05)。与模型组相比，密骨打老儿丸高剂量组、密骨打老儿丸低剂量组、雌二醇组骨组织总面积、骨小梁面积、骨小梁周长显著增加 (P＜0.01)，骨小梁厚度无明显差异 (P＞0.05)。

表4 对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨上段骨组织形态计量学静态参数的影响( ± s，n=12)Tab.4 Effects of M igu Dalao'er Pills on the proximal tibia static histomorphometric parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲▲P＜0.01。

组别骨组织总面积/mm2 骨小梁面积/mm2 骨小梁周长/mm 骨小梁厚度/μm假手术组13.53±0.65 3.11±0.52 68.42±5.32 71.25±7.83模型组 9.12±0.62＊＊ 1.83±0.56＊＊ 43.26±5.56＊＊ 64.35±7.14密骨打老儿丸低剂量组 11.05±0.67▲▲ 2.51±0.57▲▲ 52.14±5.13▲▲ 68.23±8.16密骨打老儿丸高剂量组 11.56±0.58▲▲ 2.61±0.54▲▲ 55.72±5.28▲▲ 71.19±7.15雌二醇组 11.21±0.64▲▲ 2.57±0.61▲▲ 53.63±5.17▲▲70.65±7.24

3.4.2 对胫骨上段骨组织计量学动态参数的影响见表5。与假手术组比较，模型组骨小梁标记周长百分率、BFR/BV、BFR/TV显著降低 (P＜0.01)。与模型组相比，密骨打老儿丸高剂量组、密骨打老儿丸低剂量组、雌二醇组骨小梁标记周长百分率、BFR/BV、BFR/TV显著增加 (P＜0.01)。

表5 对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨上段骨组织形态计量学动态参数的影响( ± s，n=12)Tab.5 Effects of M igu Dalao'er Pills on the proximal tibia dynam ic histomorphometric parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较。▲▲P＜0.01。

组别标记周长百分率/% 年骨形成率/%BFR/BV BFR/TV假手术组16.45±2.85 91.23±23.27 19.98±6.12模型组 7.01±2.16＊＊ 35.18±22.53＊＊ 5.81±5.93＊＊密骨打老儿丸低剂量组 10.35±2.43▲▲ 58.64±22.87▲▲ 12.37±5.75▲▲密骨打老儿丸高剂量组 10.83±2.38▲▲ 59.73±23.01▲▲ 12.98±6.04▲▲雌二醇组 9.83±2.15▲▲ 58.26±22.83▲▲ 12.13±5.72▲▲

3.5 对第4腰椎生物力学参数的影响见表6。与假手术组比较，模型组弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、刚度显著降低 (P＜0.01)。与模型组相比，密骨打老儿丸高剂量组、密骨打老儿丸低剂量组、雌二醇组弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、刚度显著增加 (P＜0.01)。

表6 对去卵巢骨质疏松大鼠第4腰椎生物力学参数的影响( ± s，n=12)Tab.6 Effects of M igu Dalao'er Pills on the forth lumbar vertebrae(LV4)biomechanics parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:与假手术组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲▲P＜0.01。

组别弹性载荷/N 最大载荷/N 断裂载荷/N 刚度/(N·mm－1)假手术组 231.62±22.15 275.61±35.69 241.23±31.27 696.32±121.37模型组 169.47±21.42＊＊ 196.14±35.26＊＊ 171.25±31.20＊＊ 458.65±124.27＊＊密骨打老儿丸低剂量组 213.25±23.64▲▲ 262.57±34.51▲▲ 218.17±32.62▲▲ 601.13±123.76▲▲密骨打老儿丸高剂量组 217.51±22.57▲▲ 265.67±35.24▲▲ 221.35±31.24▲▲ 605.28±127.85▲▲雌二醇组 211.51±22.63▲▲ 259.31±34.68▲▲ 213.34±32.54▲▲ 591.34±126.13▲▲

4 讨论

绝经后妇女卵巢功能减退，雌激素水平降低，骨吸收亢进，造成骨质流失，与老龄造成的低转化型骨质疏松相比，绝经后妇女骨质疏松属于高转化型骨质疏松。骨基质中90%是骨胶纤维，胶原吡啶交联包括吡啶酚 (Pyr)和脱氧吡啶酚 (D-Pyr)两种成熟的交联氨基酸，D-Pyr只存在于骨骼和牙质的Ⅰ型胶原中，因牙质转换速度慢，在整体骨骼所占的份额极小，所以尿中的D-Pyr几乎全来自矿化骨的骨吸收。尿中D-Pyr是骨吸收最为特异敏感的指标［10］。临床观察绝经后妇女血清 ALP活性升高，u-Ca、尿D-Pyr排出量增加，骨吸收强于骨形成。研究发现 Pyr和 D-Pyr在绝经时增加50% ～100%，经雌激素治疗后可降至绝经前水平，并在绝经两年的追踪研究后发现，D-Pyr测定与骨丢失率显著相关［11］。本实验采用去卵巢大鼠模拟绝经后妇女骨质疏松，结果显示，去卵巢后大鼠血清ALP活性增加，u-Ca、D-Pyr/Cr排出显著增加，与绝经后妇女骨质疏松患者的临床生化指标的变化一致。ALP反应成骨细胞的成骨活性［12］，实验结果表明，通过卵巢切除人为地造成卵巢功能破坏，雌激素水平下降，骨吸收代谢加强，骨基质中的Ⅰ型胶原分解加速，骨丢失率显著上升，造成雌激素缺乏引起的骨转换亢进骨质疏松病理模型。

打老儿丸来源于《万氏家抄方·卷四》，组成是石菖蒲、干山药、川牛膝、远志、巴戟天、川续断、五味子、楮实子、杜仲、山萸肉、茯神、熟地黄、小茴香、肉苁蓉、枸杞子各等份。打老儿丸的配伍涉及五脏，其中以川牛膝、巴戟天、川续断、楮实子、杜仲、山萸肉、熟地黄、肉苁蓉、枸杞子补肾药为主，石菖蒲、远志、茯神养心安神，山药补脾，五味子敛肺，小茴香温肝。本课题组证实打老儿丸中地黄［6］、川续断［2］、川牛膝［3］可以提高成骨细胞增殖和分化能力，再加上具有促进成骨作用的淫羊藿［5］、骨碎补［4］、补骨脂［1］、菟丝子［7］，组成密骨打老儿丸。本实验结果表明，给去卵巢骨质疏松大鼠灌胃密骨打老儿丸3个月，血清 ALP活性显著降低，u-Ca、D-Pyr/Cr排出量降低，骨密度增加，能够显著抑制由于雌激素缺乏引发的骨转换亢进，调整骨形成和骨吸收的平衡，对遏制去卵巢造成的骨质疏松有一定的作用。并且与雌激素相比，长期服用密骨打老儿丸对子宫没有刺激增生的作用。

骨骼在一生中不断地进行更新和转换，破骨细胞将其吸收，成骨细胞又不断在原位形成新骨，两种细胞在骨表面同一部位相继进行着骨的重建活动，每年约有数百万重建单位 (BMU)在骨表面上发生，骨组织内外有大量表面，包括骨外膜表面、骨内膜表面、骨小梁表面、哈佛管表面等，如果骨形成的骨量少于被吸收骨量时即发生负平衡。在BMU负平衡的状态下，骨转换越高，骨丢失也越严重，骨质疏松的发病部位主要在骨小梁。目前多用骨密度作为指标来评价骨质疏松药效，但单纯追求骨密度提高，会引起骨硬化，导致骨生物力学性能恶化，骨矿量提高和骨生物力学性能改善之间不能划等号［7］，骨密度、含钙、磷量仅反应骨矿的“量”，而骨的生物力学参数则反应骨的“质”，应该综合考察反映骨“质”和“量”的双重指标，才能更客观地评判抗骨质疏松药物内在质量的优劣。弹性载荷、最大载荷、断裂载荷等指标反映骨结构力学性能，而刚度用来衡量材料在载荷作用下，抵抗变形的能力。本实验结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠股骨骨密度、第4腰椎生物力学参数的弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、刚度均降低，胫骨上段骨组织计量学静态参数的骨组织总面积、骨小梁面积、骨小梁周长和动态参数的标记周长百分数、骨形成率 (BFR/BV、BFR/TV)均降低，提示去卵巢诱发的大鼠骨质疏松模型是成功的。本实验结果表明，密骨打老儿丸治疗后，大鼠腰椎生物力学参数的弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、刚度，胫骨上段骨组织计量学静态参数的骨组织总面积、骨小梁面积、骨小梁周长和动态参数的标记周长百分数、骨形成率 (BFR/BV、BFR/TV)均明显增加。结果提示密骨打老儿丸可以防治去卵巢所致的骨质疏松大鼠腰椎生物力学性能的降低，可以增强椎骨的抗变形能力，减少骨折的发生，提高骨质量，详细的机理尚待进一步深入研究。

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