空心莲子草多糖定量测定比较
2013-09-14蔡凌云肖德智朱晓芳张晓锋潘步恒肖恩杰
蔡凌云， 肖德智， 朱晓芳， 张晓锋， 潘步恒， 肖恩杰， 李 燕
(1.凯里学院环境与生命科学学院，贵州凯里556011;2.西华师范大学生命科学学院，西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充637009)
空心莲子草 Alternanthera philoxeroides(Mart．)Griseb，原产于巴西，又名革命草、水花生、喜旱莲子草，为苋科Amaranthaceae莲子草属Alternanthera Forsk植物，1930年传入中国，被列为中国首批外来入侵物，但具有药用价值。性味甘寒无毒，具有清热、凉血、解毒的功效。武汉市传染病院，四川中草药研究所，武汉医学院微生物教研系等有关单位，对空心莲子草进行了预防流感、防治流脑、临床观察及抑制病毒等研究实验，发现对亚洲甲型流感病毒，乙脑和狂犬病毒、肝炎病及部分呼吸道病毒均有明显的抑制作用［1-9］，我们前期研究表明空心莲子草多糖抗氧化活性很强［10］，以其为原料开发生物活性多糖具有较大经济价值，但空心莲子草多糖定量测定尚未见报道。测定多糖量的方法很多，其中一类是利用多糖的还原性如3，5-二硝基水杨酸盐 (DNS)比色法和Somogyi-Nelson法。另一类，即利用糖类在无机强酸条件中发生脱水反应生成醛类，并与酚类等物质缩合，生成特定的有颜色的物质，且有色物质的吸光值与多糖浓度成正比，如苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法［11］。在对照品的选用上目前也待考究。葡萄糖价格低廉和来源方便，得到广泛应用。但比色法测定时，对照品与被测样品的结构类似，结果更准确。如测粗多糖量时，对照品分别为葡萄糖和葡聚糖，前者测的结果不同程度的偏高，所以，用葡萄糖作为测定多糖量不是很合适［12-14］。基于这些实验事实，人们开始逐渐改用葡聚糖作对照品为测定粗多糖量的，最为广泛使用的是分子量为500 000的葡聚糖，故本实验拟用葡聚糖 (T-500)作对照品研究空心莲子草多糖量的测定方法，为确定空心莲子草多糖定量测定方法和质量控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 空心莲子草2011年6月采集于凯里学院实验田边，经生命科学学院周江菊教授鉴定为苋科莲子草属植物空心莲子草Alternanthera philoxeroides(Mart．)Griseb。
葡聚糖 (T-500)德国Ruibio公司;其他实验试剂均为分析纯;实验用水为蒸馏水。
1.2 仪器与设备 瑞士BUCHIR-200旋转蒸发仪;德国Eppendorf Research移液器;北京普析通用TU-1900双光束紫外-可见分光光度计;昆山KQ3200DE数控超声清洗器;LD4-2低速离心机;ST841-3红外线快速节能干燥箱;北京赛多利斯BT124S电子天平。
1.3 方法
1.3.1 多糖的提取与精制 准确称取自然干燥的空心莲子草粉末10 g，置于500 mL的锥形中加20倍蒸馏水，超声提取20 min，功率100%，温度40℃，冷却，减压过滤，残渣按第一次操作步骤重复一次。合并提取液，减压浓缩。用savage法反复除去蛋白，加入100%乙醇，放置于4℃冰箱冷藏过夜，然后在4 000 r/min离心10 min，弃上清液，残渣用乙醇洗涤后用水溶解后定容于50 mL量瓶中，加入100 mL 100 g/L氢氧化钠溶液、100 mL 100 g/L铜试剂溶液，沸水浴中煮沸2 min，冷却，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残渣用洗涤液洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣供测定多糖量用。
1.3.2 对照品溶液的制备 准确称取50 mg葡聚糖对照品(105℃干燥至恒定质量)，用蒸馏水溶解并定容250 mL，得0.2 mg/mL的葡聚糖对照品液。
1.3.3 多糖测定 葡聚糖为对照品，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，分别测定吸光度。
1.3.4 检测波长的确定
1.3.4.1 苯酚-硫酸法 分别取对照品和样品溶液各1 mL，各加蒸馏水使其均达到2 mL，并以2 mL蒸馏水做空白对照，分别加入4 mL苯酚溶液和10 mL浓硫酸，在沸水浴中加热5 min显色，立即用流动的冷水冲洗使其冷却，在300～600 nm扫描，测定其最大吸光值。
1.3.4.2 蒽酮-硫酸法 取对照品和样品溶液各1mL，分别加蒸馏水使均达到2 mL。冰水浴处理5 min，再分别加入新配制蒽酮-硫酸溶液4 mL，摇匀，沸水浴加热20 min，自来水冷却至室温，在300～600 nm扫描，测定其最大吸光值。
1.3.5 标准曲线的绘制 准确吸取对照品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，按1.3.4项下方法分别测定吸光度，以吸光值A为纵坐标，葡聚糖质量浓度C为横坐标分别绘制苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的标准曲线，得回归方程。
1.3.6 精密度试验 精密吸取样品溶液6份，按1.3.4项下方法分别测定吸光度，计算RSD。
1.3.7 稳定性试验 精密吸取样品溶液，在1 h内，每隔10 min按1.3.4项下方法分别测定吸光度，计算RSD。
1.3.8 加样回收实验 精密吸取样品溶液6份，分别加入标准溶液，按1.3.4项下方法测定多糖量，计算RSD。
1.3.9 空心莲子草粉多糖量的测定 精密吸取样品溶液1 m L，按1.3.4项下方法操作，测定其吸光值 (3个平行)，代入回归方程计算样品溶液中葡聚糖平均质量浓度C。按照下式计算多糖质量分数 (单位mg/g):
多糖量 =CD/W
式中，C为1 mL样品溶液中葡聚糖的质量浓度 (mg/mL);D为多糖的稀释因素;W为称取样品的质量 (g)。
2 实验结果
2.1 波长确定 苯酚-硫酸法样品和对照品在446 nm处都有最大吸收，故实验时在446 nm处测定其吸光值。蒽酮-硫酸法样品和对照品在波长626nm处都有最大吸收，故实验时在626 nm处测定其吸光值。
2.2 标准曲线绘制 标准曲线 (苯酚-硫酸)的回归方程为A=30.457C+0.001 1，相关系数 r=0.999 5，在0～0.019 mg/mL范围内呈良好的线性关系。标准曲线 (蒽酮-硫酸)的回归方程为A=10.505C+0.003 6，相关系数r=0.998 3，在0～0.04 mg/m L范围内呈良好的线性关系。
2.3 精密度、稳定性、回收率试验结果。见表1～3。
表1 精密度实验结果
表2 稳定性实验结果
4 结论与讨论
本实验用超声辅助提取空心莲子草中的多糖类化合物，用碱性二价铜选择性地从其他高分子物质中沉淀出具有葡聚糖结构的多糖，沉淀部分与苯酚-硫酸或蒽酮-硫酸反应，生成有色物质，在446 nm和626 nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖质量浓度存在定量关系。反应迅速完全，有色物质稳定。以葡聚糖为对照品，用苯酚-硫酸法 (446 nm)测出空心莲子草多糖的质量分数3.95 mg/g，用蒽酮-硫酸法 (626 nm)测出空心莲子草多糖的质量分数为4.46 mg/g。具体见表4。蒽酮-硫酸法测定结果较苯酚-硫酸法偏高。蒽酮-硫酸法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用蒽酮-硫酸法测出的碳水化合物量实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。因此，蒽酮-硫酸法测定结果高于苯酚-硫酸法。实验结果显示苯酚-硫酸法，结果更稳定、准确，可将其作为空心莲子草多糖定量测定的有效方法。
表3 加样回收率实验结果
表4 多糖量的测定结果
葡聚糖是多糖中的一类，被认为是最具生理活性的一种多糖，所以卫生部要求多糖量的标准应以葡聚糖计量。我们首次以葡聚糖为对照品，测定空心莲子草多糖量，研究结果显示空心莲子草多糖量丰富，为空心莲子草多糖的开发提供了依据，但对空心莲子草多糖的定性分析和结构组成，有待进一步的研究。
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