通络益肾方对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞MMP-9/TIMP-1和TGF-β1表达的影响

李小会， 赵明君， 雷根平， 苏衍进

(1.陕西中医学院，陕西咸阳712046;2.陕西中医学院附属医院，陕西咸阳712046)

糖尿病肾病 (diabetic nephropathy)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症，是糖尿病心、脑、肾三大严重并发症之一。在欧美发达国家，糖尿病已成为终末期肾病的主要原因，慢性肾功能衰竭透析病人中糖尿病肾病占43%左右，并已成为糖尿病的主要死亡原因之一［1］，在我国糖尿病的患病率快速上升，糖尿病肾病在终末期肾病中占15%。根据糖尿病肾病的病机特点［2］——消渴日久，肾亏阴阳两伤;同时“肾络瘀阻”贯穿糖尿病肾病病程始终，更是产生并发症的病理基础，抓住“肾虚”与“肾络瘀阻”的主要病机，采用通络益肾法以经方肾气丸合抵当汤化裁组成通络益肾方，前期的临床和实验研究均证实该方能改善糖尿病肾病患者及大鼠的血糖、血脂、肾功能［3-5］。本实验通过进一步的实验研究，观察高糖下大鼠肾小球系膜细胞 (glomerularmesangial cell)增殖、细胞外基质 (extracellularmatrix)调控系统基质金属蛋白酶-9/金属蛋白酶组织抑制物-1(Matrix metalloproteinase-9/Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，MMP-9/TIMP-1)和转化 生 长 因 子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表达及该方的干预效果，从细胞水平探讨其肾保护机制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。通络益肾方(桃仁12 g、生地30 g、山萸肉15 g、山药15 g、酒大黄10 g、水蛭3 g、黄芪30 g、淫羊藿10 g、葛根12 g、泽泻12 g、茯苓12 g、牛膝12 g，水煎，每日一剂)。药物经过常规煎煮、过滤、水浴蒸发至每毫升含生药材2.23 g，置于4℃冰箱保存备用。盐酸贝那普利 (洛汀新)，规格10 mg/片，北京诺华制药有限公司生产;糖适平规格为30 mg/片，北京万辉双鹤药业有限责任公司生产。

四甲基偶氮唑盐 (MTT)购自Sigma公司，二甲基亚砜 (DMSO)、胰蛋白酶购自CIBCO公司，MMP-9 ELISA试剂盒、TIMP-1 ELISA试剂盒购自美国RB公司。

1.2 方法

1.2.1 制备含药血清 健康雄性SD大鼠35只，体质量 (180±20)g，适应性喂养1周后，随机分为5组，即空白对照组、西药对照组、通络益肾方大、中、小剂量组，每组7只。通络益肾方大、中、小剂量组各按13.4 g/(kg·d)、6.7 g/(kg·d)、3.35 g/(kg·d)灌胃给相应中药，西药对照组按糖适平18 mg/(kg·d)加洛汀新5 mg/(kg·d)灌胃给药，正常对照组给予等体积生理盐水灌胃。每天1次，连续给药7 d。于末次给药2 h后，颈动脉取血，离心取血清，56℃水浴30 min灭活补体，除菌过滤后，分装冻存。

1.2.2 实验分组及药物处理 参考文献 ［6-7］，取对数增长期的3～5代大鼠肾小球系膜细胞，胰蛋白酶消化计数后接种于孔板中，待细胞完全贴壁，弃上清，加入不含胎牛血清的RPMI1640培养基同步化24 h后，吸掉培养上清，分组加入药物血清。实验共分6组:高糖组只加入30 mmol/L葡萄糖;空白对照组加入30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清;通络益肾方中药治疗组 (设大、中、小三个剂量组)加入30mmol/L葡萄糖+通络益肾方大、中、小剂量10%的含药血清;西药对照组加入30 mmol/L葡萄糖+洛汀新、糖适平10%的含药血清。每组设12个复孔。置于37℃，5%CO2细胞培养箱中常规培养48 h后待检。

1.2.3 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法 (MTT法)检测系膜细胞增殖 上述各实验组细胞培养48 h后，弃去培养板各孔中培养液，加入PBS 200 μL冲洗两次，再加入180μL培养液以及MTT溶液，37℃孵育4 h终止培养，加入 DMSO 150μL，室温避光震荡10 min，于酶标仪检测各孔570 nm处的吸光度值 (A570)。

1.2.4 培养上清液中 TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的检测 采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞培养液上清 TGF-β1、MMP-9及 TIMP-1水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件进行处理，实验数据以均数±标准差 (± s)表示，两组间比较采用t检验，多组数据比较用方差分析，以P≤0.05为检验水准。

2 结果

2.1 通络益肾方对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响 与空白对照组比较，高糖组肾小球系膜细胞显著增殖 (P＜0.01);与高糖组比较，通络益肾方高、中、低各剂量组均能显著抑制肾小球系膜细胞增殖 (P＜0.01或P＜0.05)，其中以高剂量组效果最佳，呈剂量依赖性;西药对照组对肾小球系膜细胞增殖的抑制作用和通络益肾方中剂量组相当 (P＞0.05)。见表1。

2.2 通络益肾方对高糖诱导肾小球系膜细胞上清液中TGF-β1、MMP-9和 TIMP-1表达的影响 与空白对照组比较，高糖组大鼠肾小球系膜细胞培养上清液中TGF-β1和TIMP-1水平显著增加，MMP-9水平呈著减少 (均P＜0.01);与高糖组比较，通络益肾方大、中、小剂量组 TGF-β1和 TIMP-1水平均显著减少，MMP-9表达升高 (P＜0.05或P＜0.01)，尤以高剂量组疗效最佳，呈剂量依赖性;西药对照组上述指标表达水平和通络益肾方中剂量组相当，两组比较P＞0.05。见表2。

表1 通络益肾方对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响( ± s)Tab.1 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomerular mesangial cell proliferation

表1 通络益肾方对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响( ± s)Tab.1 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomerular mesangial cell proliferation

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与高糖组比较，△P＜0.05，△△P ＜0.01;与西药对照组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与通络益肾方大剂量组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。

组 别 动物数/只 OD值空白对照组12 0.61±0.33高糖组 12 0.89 ±0.41＊＊西药对照组 12 0.72 ±0.49＊＊△通络益肾方大剂量组 12 0.66±0.25△△#通络益肾方中剂量组 12 0.73±0.38△△★通络益肾方小剂量组 12 0.81±0.51△★★

表2 通络益肾方对MC TGF-β1、MMP-9和TIMP-1表达的影响 ( ± s，μg/L)Tab.2 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomeru lar mesangial cell，TGF-β1，MMP-9 and TIMP-1

表2 通络益肾方对MC TGF-β1、MMP-9和TIMP-1表达的影响 ( ± s，μg/L)Tab.2 Effects of Tongluo Yishen Form ula on glomeru lar mesangial cell，TGF-β1，MMP-9 and TIMP-1

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与高糖组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与西药对照组比较，#P＜0.05;与通络益肾方大剂量组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。

组 别 动物数/只 TGF-β1MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1空白对照组 12 55.91±8.37 38.54±6.80 18.45±2.70 1.57±0.18高糖组 12 88.49±9.32＊＊ 18.75±5.65＊＊ 29.74±3.78＊＊ 0.64±0.04＊＊西药对照组 12 74.76±6.93＊＊ 28.26±4.40△＊＊ 21.68±3.74△＊ 1.18±0.07△＊通络益肾方大剂量组 12 60.34±7.28△△# 35.59±4.67△△# 18.75±0.91△△# 1.51±0.15△△#通络益肾方中剂量组 12 71.89±6.85★△△ 29.77±5.63△△★ 22.71±2.92△★ 1.25±0.11△★通络益肾方小剂量组 12 80.76±9.15★★△ 24.48±4.75△★★ 25.47±2.62△#★ 0.87±0.09△#★★

3 讨论

糖尿病肾病的主要病理变化为肾小球基底膜增厚、细胞外基质增多和肾小球结节性或球性硬化。其中细胞外基质合成/降解失衡以及由此导致的细胞外基质过度积聚是导致肾小球硬化的直接原因。细胞外基质堆积是肾小球纤维化的基础，是糖尿病肾病发展成终末期肾病的核心问题［8］。既往有关糖尿病肾病中细胞外基质变化的研究多关注于其合成增多的过程，而晚近研究显示细胞外基质降解能力下降在糖尿病肾病的发生、发展中起着更为重要的作用，并已成为研究的热点。基质金属蛋白酶系统 (matrix metal loproteinases，MMPs)是调控肾脏细胞外基质代谢的重要降解酶系统，能降解除多糖以外的所有细胞外基质成分［9］。其中MMP-9主要由肾小球系膜细胞分泌，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原，从而降解细胞外基质。TIMP-1是MMP-9的特异性抑制因子，能与活性MMP-9以1∶1比例结合形成不可逆复合物，阻断MMP-9与底物结合，从而减少细胞外基质的降解。因此，MMP-1/TIMP-1在细胞外基质积聚和降解的生理平衡中起关键作用［8］。同时，在糖尿病肾病肾小球硬化的过程中，多种细胞因子形成网络参与其中，而TGF-β1为这些复杂细胞因子网络的中心因子［10］，在糖尿病肾病的发病中占有重要地位。实验证实TGF-β1可促进肾小球系膜细胞过度增殖，作用呈剂量依赖性［11］。其通过促进肾小球系膜细胞过度增殖［12］;增加细胞外基质蛋白如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV型胶原、纤连蛋白，层连蛋白的合成，使其在肾小球沉积［13］;促进蛋白酶抑制因子 (纤溶酶原激活抑制因子PAI)、TIMP-1的合成，抑制MMP-9的生成与活化，最终导致细胞外基质的过度沉积［14］，因此其被认为是引起肾小球硬化的最关键的细胞因子。

通络益肾方由抵当汤合肾气丸化裁组成，方中生地黄、山萸肉滋阴补肾;水蛭、酒大黄、桃仁活血破血、逐瘀通经;山药健脾补肺、益肾固精。此三药补虚兼以破瘀，共为臣药。黄芪补气生阳、利水消肿;附子辛性温补肾阳、补火暖土;泽泻、茯苓利水渗湿泄浊;川牛膝补益肝肾、逐瘀通经利水，兼具佐使之用。全方合用，消补兼施，活血通络，滋阴助阳，与糖尿病肾病之肾亏阴阳两虚，血瘀络阻病机针对性符合，故而取得较好疗效。本实验研究结果显示，高糖能明显促进大鼠肾小球系膜细胞增殖，细胞上清液中TGF-β1和TIMP-1水平显著增加，MMP-9水平减少，导致细胞外基质聚集;通络益肾方低、中、高剂量组均能显著抑制肾小球系膜细胞增殖，使TGF-β1和TIMP-1水平减少，MMP-9水平增加，以高剂量组作用最佳，呈剂量依赖性;西药对照组对肾小球系膜细胞增殖的抑制作用和通络益肾方中剂量组相当。提示通络益肾方可能通过抑制肾小球系膜细胞增殖和下调TGF-β1、TIMP-1，升高MMP-9水平以促进细胞外基质的降解而发挥对糖尿病肾病的保护作用。

［1］Rai JL．Recommendations for themanagementof special populations:renal disease in diabetes［J］．Am JHyPertens，2003，16(11):46-49.

［2］李小会，董正华，丁 辉．糖尿病肾病病因病机的探讨［J］．陕西中医，2005，26(6):552-553．

［3］董正华，杨新博，应小平，等．通络益肾汤对DN模型大鼠肾组织α-SMA表达影响的实验研究［J］．时珍国医国药，2010，21(2):357-358．

［4］董正华，宋春光，应小平，等．通络益肾汤对DN模型大鼠肾小管上皮细胞标志蛋白CK-18的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(1):88-90．

［5］董正华，通络益肾汤治疗糖尿病肾病30例［J］．上海中医药杂志，2007，41(9):46．

［6］彭 爽，曹文富，刘占术，等．解聚复肾宁对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞表达血小板衍生生长因子-β的影响［J］．中国老年学杂志，2011，31(1)65-68．

［7］赵雯红，陈志强，张江华，等．益气养阴消癥通络中药对高糖联合AngⅡ培养的大鼠系膜细胞p38MAPK信号通路的影响［J］．中国中西医结合肾病杂志，2011，12(8):669-672．

［8］Ahn JD，Morishita R，Kaneda Y，et al．Transcription factor decoy for AP-1 reducesmesangial cell proliferation and extracellularmatrix production in vitro and in vivo［J］．Gene Ther，2004，11(11):916-923

［9］段晓虹，董竞成，何立群，等．补肾活血方对肾小球硬化大鼠细胞外基质状态的影响［J］．中国中西医结合杂志，2010，30(11):1197-1200．

［10］Kanwar Y S，Wada J，Sun L，et al．Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression［J］．Exp Biol Med(Maywood)，2008，233(1):4-11.

［11］Ten Dijke P，Goumans M J，Itoh F，et al．Regulation of cell proliferation by Smad proteins［J］．JCell Physiol，2002，191(1):1-16.

［12］Saulo K，Morrissey JJ．The role vasoactive compounds，growth factors and cytokines in the progression of renal disease［J］．Kidney Int，2000，57(Suppl175):1417-1422.

［13］Sehena F P，Gesualdo L．Pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy［J］．J Am Soc Nephrol，2005，16(Suppl 1):530-533.

［14］程 虹．肾脏细胞外基质代谢的调控［J］．国外医学内科学分册，2003，30(5):477-480.