大蒜活性物质对高脂小鼠血脂代谢的影响

赵 立， 苟 萍， 王 霞， 郭星军

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

心血管疾病是当今世界威胁人类健康的严重疾病之一，发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。心脑血管疾病是一种复杂的、多因素导致的疾病，血脂(胆固醇和甘油三酯)升高是导致心血管疾病的重要原因。血清总胆固醇 (TC)水平及低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)与心血管病发病率之间呈正相关，而高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)升高可降低心血管病的发病率。目前还没有副作用小的特效降血脂药物。近年利用食物和食物中的某种成分达到降血脂的目的日益受到人们的重视，大蒜及大蒜制品在医药和保健方面的作用已得到普遍的认可。大蒜Alltim sativum L．是多年生草本植物，是百合科葱属植物蒜的鳞茎。大蒜中具有药理作用的成分是一类含硫的有机化合物，主要有S-烯丙基半胱氨酸和蒜氨酸，在蒜氨酸酶的催化下蒜氨酸缩合形成大蒜素 (Allicin，主要成分是二烷基硫代亚磺酸酯和烷基-2-丙烯基硫代亚磺酸酯)。在细胞内，大蒜素可先分解为二硫和三硫化合物，最终产生烯丙基硫醇和烯丙甲基硫化物，这些化合物有较强的反应能力，能够修饰含巯基的酶类，是大蒜起治疗作用的关键物质［1-3］。新鲜大蒜鳞茎中蒜氨酸和蒜氨酸酶在细胞的不同部位独立稳定存在，当大蒜破碎后，蒜氨酸和蒜氨酸酶相互接触，蒜氨酸酶催化蒜氨酸生成有挥发性的大蒜素。体外及动物体内的实验已证实大蒜素通过调节血脂代谢降低血脂，大蒜素在临床上防治心脑血管疾病应用日趋广泛，但是大蒜素理化性质不稳定，在常温下可进一步分解，生物半衰期短 (t1/2=2．32 h)，因而影响其药理作用及疗效［4］。大蒜素的前体物质蒜氨酸和蒜氨酸酶较稳定，本实验通过分别制取蒜氨酸和蒜氨酸酶，比较大蒜素与蒜氨酸+蒜氨酸酶对高血脂小鼠血脂代谢的影响，为更好地开发利用大蒜中的降血脂活性成分提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料及主要仪器

1．1．1 材料 市售新鲜吉木萨尔县大蒜。

1．1．2 试剂 总胆固醇测定试剂盒、甘油三脂检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒、低密度脂蛋白-胆固醇检测试剂盒、超氧化物歧化酶检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒 (均购于南京建成生物工程研究所，批号090219)，3-羟-3-甲戊二酸卓酰辅酶 A(HMG-CoA)、二硫苏糖醇 (DTT)、还原型辅酶Ⅱ (NADPH)为Sigma产品，其余药品均为分析纯。

1．1．3 主要仪器 SZ2型双配套循环水式多用真空泵;减压旋转蒸发仪;冷冻干燥机;高效液相色谱仪;日立超高速离心机;酶标仪。

1．2 实验动物 昆明种小白鼠，体质量 (25±2)g，雌雄兼用，购于新疆医科大学动物实验中心。动物基础饲料购于新疆医科大学动物实验中心。高脂饲料配方:78．8%基础饲料中加入1%胆固醇，10%猪脂肪油，10%蛋黄粉，0．2%胆酸盐。

1．3 试验方法

1．3．1 大蒜素的制备及测定 称取鲜蒜瓣100 g，加 pH 6．4 NaH2PO4-K2HPO4缓 冲 液 100 mL(蒜瓣∶提取液=1∶1)，于组织捣碎机中破碎匀浆，匀浆液在32℃水浴中充分酶解30 min，加入95%乙醇 (料液比=1∶4)，在32℃水浴中萃取1 h，萃取液抽滤，滤液置于旋转蒸发仪，浓缩至10 mL左右，冷冻干燥，即得到大蒜素。大蒜素质量浓度的测定采用 DTNB［5，5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)］比色法［5］，大蒜素含量的计算公式为:C=ΔA412×d×162．26/(2×14150)(ΔA412=A0-A)。

式中:C为大蒜素的质量浓度 (mg/mL);d为总稀释倍数;162．26为大蒜素相对分子质量;14 150为DTNB与大蒜素反应产物NTB(2-硝基-5-硫代苯甲酸)在412 nm、1 cm光径的摩尔消光系数;A0为大蒜素在412 nm处的吸光值;A为DTNB与大蒜素反应产物NTB在412 nm处的吸光值。

大蒜素得率 (g/kg)=提取液或产品中大蒜素的质量 (g)/大蒜原料的质量 (kg)

通过公式计算浓缩液中大蒜素质量浓度为0．3 mg/mL，其得率为 2．34 g/kg。

1．3．2 蒜氨酸的分离纯化及鉴定 参照黄雪松等方法提取［6］。称取去皮新鲜大蒜200 g，将蒜瓣在沸水中加热煮沸10 min，使蒜氨酸酶失活，冷却。将蒜瓣和100 mL蒸馏水置于捣碎机中打浆，用八层纱布过滤蒜汁，真空抽滤，除去大蒜组织颗粒等杂质，得到大蒜汁。将大蒜汁液上阳离子交换树脂柱，先用去离子水洗至中性后，再用0．7 mol/L氨水洗脱，将含有蒜氨酸的洗脱液合并，经真空浓缩，加入乙醇，调节 pH值为5．5至6．5，4℃冰箱中静置可得到蒜氨酸结晶，HPLC检测纯度达95% 以上［7］。

1．3．3 蒜氨酸酶的提取分离与活力测定 称取去皮鲜蒜200 g，放入组织捣碎机置4℃冰箱预冷。向组织捣碎机中加入4℃预冷的Na/K磷酸缓冲液200 mL(蒜瓣∶提取液=1∶1)，破碎匀浆，在4℃4 000 r/min离心20 min，弃去残渣。将上清液加入20%饱和硫酸铵，4℃下静置2 h，8 000 r/min离心20 min，弃去沉淀。再向上清液中加入50%饱和硫酸铵，4℃下静置过夜，8 000 r/min离心20 min，沉淀即为蒜氨酸粗酶。蒜氨酸酶活力的测定采用丙酮酸法［8］，测得酶活力单位为24 720 U/mg。

1．3．4 高血脂模型建立 昆明种小白鼠90只，经1周适应性喂养后，禁食12 h，尾静脉取血测定总胆固醇，根据测定的胆固醇水平分为9组，每组10只，各组间无统计学差异。9组分别为对照组(饲喂基础饲料)，高血脂模型组 (饲喂高脂饲料)，高脂饲料+大蒜素高、中、低剂量组，高脂饲料+蒜氨酸+蒜氨酸酶高、中、低剂量组及血脂康组。腹腔注射给药，注射量为0．1～0．2 mL/10 g体质量。对照组和模型组每天注射等量0．9%生理盐水，大蒜素高剂量组、中剂量组和低剂量组给药剂量分别为10 mg/mL、5 mg/mL和2 mg/mL。蒜氨酸+蒜氨酸酶混合液 (2∶1)高剂量组、中剂量组和低剂量组给药剂量分别为10 mg/mL、5 mg/mL和2 mg/mL，血脂康的剂量为2 mg/mL。实验期间自由饮水和进食，连续8周。末次给药后，所有动物禁食12 h，眼底静脉取血，血液在37℃下水浴30 min，3 500 r/min离心15 min，分离血清，用 试 剂 盒 测 定 TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、MDA。

1．3．5 HMG-CoA还原酶测定 小鼠肝微粒体HMG-CoA还原酶制备参照文献 ［9-10］董朝辉、李鹏等的方法，HMG-CoA还原酶活力测定按文献［11］的方法进行。1个酶活力单位 (U)定义为1 L溶液中每分钟消耗1μmol的HMG-CoA所需的酶量。

2 结果

2．1 高脂小鼠模型的建立

高脂饲料饲喂的小鼠体质量发生明显变化，与对照组比较，四周后体质量增加达20%(见表1)。高脂饲料喂养2周后，TC和TG水平分别上升了33．3% 和12．5%。喂养4周后，TC和 TG水平分别上升了45．5%和37．5%，方差分析显示有显著差异 (P＜0．01)，小鼠高脂模型构建成功。

表1 建模过程小鼠体质量及血脂水平的变化(n=10)Tab.1 Body weight and blood lipids ofm ice changes in setup models(n=10)

2．2 大蒜生理活性物质对高血脂小鼠血浆脂蛋白的影响

实验结果表明高、中、低剂量的大蒜素组与高血脂组相比，TC水平分别降低32．1%、29．1%和25．2%，差异显著，P＜0．001。高、中、低剂量的蒜氨酸 +蒜氨酸酶分别降低33．4%、27．7%和25．9%，差异显著，P＜0．001。高剂量组的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶降低TC的有效率接近于血脂康组。高、中、低剂量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能一定程度的降低高脂小鼠血清TG水平。高、中、低剂量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能提高高血脂小鼠血清中HDL-C的水平，降低LDL-C水平，与高血脂组相比，差异显著，P＜0．001(表2)。

表2 大蒜活性物质对高血脂小鼠血脂水平的影响(n=10， ± s)Tab.2 Effect of garlic active substances on serum lipids in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

表2 大蒜活性物质对高血脂小鼠血脂水平的影响(n=10， ± s)Tab.2 Effect of garlic active substances on serum lipids in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

注:与高血脂组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，＊＊＊P ＜0．001。下表同。

组 别TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)空白对照组 2．253 ±0．32 0．826 ±0．056 1．809 ±0．211 1．771 ±0．109高血脂组 4．15 ±0．76 2．274 ±0．155 1．098 ±0．328 2．467 ±0．413血脂康组 2．687 ±0．277＊＊＊ 1．809 ±0．108 1．686 ±0．217＊＊＊ 1．821 ±0．124＊＊＊低剂量蒜素组 3．106 ±0．187＊＊＊ 2．227 ±0．102 1．286 ±0．167＊＊＊ 2．203 ±0．310＊＊＊中剂量蒜素组 2．941 ±0．219＊＊＊ 2．035 ±0．121 1．346 ±0．308＊＊＊ 2．164 ±0．236＊＊＊高剂量蒜素组 2．819 ±0．231＊＊＊ 1．892 ±0．097 1．432 ±0．242＊＊＊ 1．998 ±0．115＊＊＊低剂量蒜氨酸 +蒜酶组 3．074±0．112＊＊＊ 2．174±0．171 1．292±0．109＊＊＊ 2．121±0．259＊＊＊中剂量蒜氨酸 +蒜酶组 3．002±0．181＊＊＊ 2．094±0．144 1．364±0．286＊＊＊ 2．099±0．144＊＊＊高剂量蒜氨酸 +蒜酶组 2．761±0．138＊＊＊ 1．831±0．261 1．498±0．181＊＊＊ 1．911±0．208＊＊＊

2．3 大蒜活性物质对高血脂小鼠SOD酶活力及MDA水平的影响

超氧化物歧化酶 (SOD)是体内重要的氧自由基清除剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。丙二醛 (MDA)是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用而形成的脂质氧化终产物。SOD活力和MDA水平的高低可反应机体清除氧自由基的能力和机体细胞受自由基攻击的严重程度。高血脂症可以抑制SOD的表达和分泌，导致血清中MDA显著增加。高、中、低剂量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶呈剂量依赖性显著提高高血脂小鼠血清中SOD酶活力，与高血脂模型组比较，P＜0．001，高剂量蒜氨酸+蒜氨酸酶提高SOD活力近于血脂康 (表3)。MDA测定结果表明，高、中、低剂量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能够降低高血脂小鼠血清中MDA，并呈现剂量依赖性。大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能通过提高SOD活性，清除氧自由基，降低血清MDA水平。

表3 大蒜活性物质对高血脂小鼠SOD与MDA的影响(n=10， ± s)Tab.3 Effect of garlic active substances on SOD and MDA in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

表3 大蒜活性物质对高血脂小鼠SOD与MDA的影响(n=10， ± s)Tab.3 Effect of garlic active substances on SOD and MDA in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

血清SOD/(U·mL-1)血清MDA/(nmol·mL-1)空白对照组219．7 ±17．3 2．285 ±0．571高血脂组 143．4 ±19．6 4．103 ±1．025血脂康组 199．2 ±25．2＊＊＊ 3．285 ±0．887＊＊低剂量蒜素组 163．9 ±12．6＊＊＊ 3．466 ±1．007中剂量蒜素组 173．4 ±10．5＊＊＊ 2．977 ±0．738＊＊高剂量蒜素组 190．3 ±14．4＊＊＊ 2．874 ±0．962＊＊低剂量蒜氨酸 + 蒜酶组 168．4 ±15．4＊＊＊ 3．234 ±0．693＊＊＊中剂量蒜氨酸 + 蒜酶组 184．0 ±17．5＊＊＊ 2．835 ±0．832＊＊高剂量蒜氨酸+蒜酶组 193．8±21．8＊＊＊ 2．641±0．799＊＊＊

2．4 大蒜活性物质对高血脂小鼠HMG-CoA还原酶活力的影响

HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的限速酶，该酶活力与体内胆固醇的合成量呈正相关。高、中、低剂量的大蒜素分别使高血脂小鼠血清中的HMGCoA 还原酶活力降低 53．5%、38．9% 和 30．3%，蒜氨酸 +蒜氨酸酶分别为 55．1%、39．6% 和33．6%，P＜0．001(表4)。大蒜素和蒜氨酸 +蒜氨酸酶能通过抑制HMG-CoA还原酶活力，降低胆固醇的合成。

表4 大蒜活性物质对高血脂小鼠肝脏HMG-CoA还原酶活力的影响 (n=10， ± s)Tab.4 Effect of garlic active substances on HMG-CoA activities in the liver of hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

表4 大蒜活性物质对高血脂小鼠肝脏HMG-CoA还原酶活力的影响 (n=10， ± s)Tab.4 Effect of garlic active substances on HMG-CoA activities in the liver of hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

HMG-CoA还原酶活力/U空白对照组1．985 ±0．478高血脂组 7．889 ±1．982血脂康组 2．946 ±0．340＊＊低剂量蒜素组 5．498 ±1．438＊＊中剂量蒜素组 4．823 ±1．228＊＊高剂量蒜素组 3．665 ±0．965＊＊低剂量蒜氨酸 + 蒜氨酸酶组 5．239 ±1．366＊＊中剂量蒜氨酸 + 蒜氨酸酶组 4．767 ±1．191＊＊高剂量蒜氨酸+蒜氨酸酶组 3．544±0．968＊＊

3 讨论

胆固醇、低密度脂蛋白 (LDL)和甘油三酯水平升高与动脉粥样硬化及心脑血管疾病的危险性增加有关。有研究发现大蒜提取物能提高高密度脂蛋白，明显降低高血脂动物总胆固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯的水平［12-15］。近年大蒜提取物降血脂的一些临床实验中得到了不一致的结果，大蒜提取物降血脂作用不显著，这可能是大蒜制品不同;其功效成分、生物有效性不同;或大蒜素不稳定，造成在临床实验中很难得到一致性的结果［16-17］。本实验利用稳定的大蒜素前药蒜氨酸+蒜氨酸酶，临用前混合进行动物实验，避免了大蒜素不稳定导致的实验结果的不确定性。本实验证实蒜氨酸+蒜氨酸酶降低高血脂小鼠总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的效果与大蒜素相当，或优于大蒜素 (表2)。蒜氨酸+蒜氨酸酶提高高密度脂蛋白胆固醇的效果优于大蒜素 (表2)，这些结果说明分别制备蒜氨酸和蒜氨酸酶，临用时混合是开发利用大蒜降血脂药物的新途径。

超氧化物歧化酶通过清除体内的氧自由基而避免脂质过氧化产生丙二醛。本实验中蒜氨酸+蒜氨酸酶能够提高SOD活力，降低丙二醛水平 (表3)，说明大蒜素降血脂的机制之一可能与抗氧化途径密切相关。高、中、低剂量的蒜氨酸+蒜氨酸酶呈剂量依赖性抑制胆固醇合成途径中的限速酶3-羟-3-甲基-戊二酸单酰CoA还原酶 (表4)，与一些学者的实验结果一致［12，18-19］。3-羟-3-甲基-戊二酸单酰CoA还原酶的活性受底物正调节和终产物的反馈调节，对控制胆固醇的合成起重要作用。因此，认为大蒜提取物抑制胆固醇的合成是降血脂的主要机制［13，20］。Gebhardt等［12，19］研究发现大蒜提取物能够抑制培养的鼠肝细胞和人肝细胞瘤HMGCoA还原酶活性，导致胆固醇合成下降;高浓度大蒜提取物及衍生物还能导致羊毛固醇、2-脱氢胆固醇和7-脱氢胆固醇积累，因此认为大蒜提取物及衍生物还能抑制HMG-CoA还原酶下游的其它与胆固醇合成相关的酶。Dev等［21］实验表明大蒜提取物能抑制胆固醇合成途径羊毛固醇下游的甾醇4α-甲基氧化酶，导致4-二甲基甾醇、羊毛固醇、二甲基酵母甾醇积累，这些物质又反馈抑制HMGCoA还原酶。蒜氨酸和蒜氨酸酶混合使用有明显的降低血脂作用，其机制可能是通过抑制肝脏胆固醇合成途径中的酶抑制了胆固醇的合成，促进血清和肝脏甘油三酯的分解;促进脂蛋白之间的代谢与转化，降低低密度脂蛋白，增加高密度脂蛋白;阻断脂质的过氧化反应。利用蒜氨酸和蒜氨酸酶的降血脂作用治疗高脂血症、预防动脉粥样硬化、冠心病等具有广阔的开发应用前景。

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