前列癃闭通片的定性定量方法研究

管 燕 ,肖 遐

(1.湖南中医药大学附属第二医院药剂科,湖南 长沙 410005;2.湖南师范大学医学院药学系，湖南 长沙 410013)

前列癃闭通片由前列癃闭通胶囊剂型改革而来[1]，由淫羊霍、黄芪、虎杖、枳壳、桃仁等十一味中药组成。具有益气温阳，活血利水功效。用于肾虚血瘀所致癃闭，症见尿频，排尿延缓、费力，尿后余沥，腰膝酸软；前列腺增生见上述证候者。因胶囊制备用的提取物为浸膏，胶囊剂在使用、存放过程中容易吸湿。不利于药效的发挥。故将其改为片剂后，采用薄膜包衣工艺，使产品的防潮性能大大提高，能有效地保障产品的疗效，并可增加临床用药的选择性，方中黄芪具有补气，利尿，抗病原微生物的作用[2]；淫羊藿对病原微生物有杀灭或抑制作用，有促进尿液分泌的作用[3]，为了更好的控制本片剂的质量，本文采用薄层色谱法对方中黄芪、虎杖、枳壳进行定性鉴别，用HPLC 法对淫羊霍中有效成分淫羊霍苷进行含量测定，为该制剂建立质量标准提供依据。

1 仪器与试药

仪器：岛津LC－10ATvp 高效液相色谱仪；HW2-000 色谱工作站。日本SHIMADZU CIV-240IPC 紫外分光光度计；BO211D 电子分析天平（西德Sartorious）。

试药：前列癃闭通片（自制），各阴性对照品（自制），黄芪甲苷标准品、虎杖对照药材柚皮苷标准品、淫羊藿苷标准品均为中国药品生物制品检定所提供；试剂：乙腈均为色谱试剂，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 薄层鉴别

2.1 黄芪的薄层鉴别试验

取本品10 片，除去包衣后，研成细粉，加甲醇40mL，加热回流2 小时，滤过，滤渣用10mL 甲醇洗涤，洗液并入滤液中，水浴浓缩至约10mL，置已处理好的中性氧化铝柱中，用40%甲醇50mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10mL 使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取3 次，每次20mL，合并正丁醇液，加氨试液振摇提取2 次，每次20mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液[4]。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL 含1mg的溶液，作为对照品溶液。再取除黄芪外的其他处方量药材，按制备工艺制成缺黄芪的阴性样品，同法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010 版一部附录ⅥB）试验[5]，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G 板上，以三氯甲烷-甲醇-水10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；缺黄芪的阴性样品无干扰，结果见图1。

2.2 虎杖的薄层鉴别试验

取本品10 片，除去包衣后，研成细粉，加乙醇30mL，浸渍2 小时，滤过，滤液蒸干。残渣加乙醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。另取虎杖对照药材1g，加乙醇15mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010 版一部附录ⅥB）试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以正已烷-醋酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，阴性对照无干扰，结果见图2。

2.3 枳壳的薄层鉴别试验

取本品5 片，除去包衣后，研成细粉，加水5mL湿润，加正丁醇30mL 超声提取40 分钟，滤过，滤液用水饱和的正丁醇振摇提取2 次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。另取，加甲醇制成每1mL 含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010 版一部附录ⅥB）试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-水-二乙胺（10∶1 .7∶1.3∶0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，结果见图3。

图1 黄芪的薄层色谱

图2 虎杖的薄层色谱

图3 枳壳的薄层色谱

3 含量测定

本品中含淫羊藿，其功效为补肾阳、强筋骨、祛风湿，其主要有效成分是淫羊藿苷，故参照中国药典2010年版一部淫羊藿项下淫羊藿苷的含量测定方法，对本品中淫羊藿苷的含量进行测定，试验结果表明，缺淫羊藿的阴性溶液无干扰，且样品分离效果好。经方法学考察，本含量测定方法结果较好，方法可行。经测定十批成品，其平均含量为0.45mg/片，故暂规定本品每片中含淫羊藿苷不得少于0.36 mg。

3.1 色谱条件

色谱柱：C18（Microsorb-MV 100-5 250mm×4.6mm，5μm）

流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（26：74）

检测波长：270nm

流速：1.0mL/min。

在选定条件下，淫羊藿苷峰与样品中其它组分色谱峰可达基线分离，且与其它相邻色谱峰分离度大于1.5；按淫羊藿苷峰计算，理论板数在2000以上。

3.2 供试品溶液的制备

参照中国药典及相关文献，本品用稀乙醇为提取溶媒进行超声提取，现对超声提取时间进行考察，方法如下。

取本品研成细粉，取三份各约0.4g，精密称定，置具塞三角瓶中，分别精密加入稀乙醇20ml，称定重量，第一份超声处理（120W，40KHz）15 分钟、第二份超声处理30 分钟、第三份超声处理45 分钟，放冷，称定重量，加稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10μl，注入液相色谱仪中，测定，结果见表1。

表1 提取时间考察结果

结果表明：超声处理15 分钟时，样品中的淫羊藿苷提取不完全，超声处理30 分钟与45 分钟时，其含量相当，均可将样品中的淫羊藿苷提取完全，因此确定超声处理时间为30 分钟。

供试品溶液制备方法：取本品10 片，精密称定，研细，取细粉0.4g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入稀乙醇20ml，称定重量，超声处理（120W，40KHz）30 分钟，放冷，称定重量，加稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

3.3 阴性样品溶液的制备

取除淫羊藿外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺淫羊藿的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺淫羊藿的阴性样品溶液。

3.4 对照品溶液的制备

精密称取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1mL 含0.025mg的溶液，即得。

3.5 专属性考察

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定。结果表明，供试品溶液色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱峰相应位置上有相应峰，而缺淫羊藿阴性溶液色谱中无此峰，说明阴性无干扰，对照品、供试品、阴性样品色谱图分别见附图。

图4 淫羊藿苷对照品HPLC 色谱图

图5 前列癃闭通片HPLC 色谱图

图6 缺淫羊藿阴性样品HPLC 色谱图

3.6 线性关系考察

精密吸取浓度为0.1025mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液（精密称取淫羊藿苷对照品10.25mg 置于100mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得）2、4、6、8、10mL，分别置25mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10μL 进样，测定其峰面积积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：A＝881410.98×C-1173.3，r＝0.9999。结果表明淫羊藿苷检测浓度在0.08～0.41μg 范围内与峰面积积分值具有良好的线性关系。

3.7 精密度试验

精密吸取同一份（批号20111125）供试品溶液10μl，重复进样5 次，测定。结果，RSD=0.86%(n=5)，表明本方法精密度良好。

3.8 稳定性试验

分别精密吸取同一份（批号20111125）供试品溶液10μl，于0、3、6、9、12 小时进样，测定。结果，RSD=0.86%(n=5)，表明供试品溶液在12 小时内基本稳定。

3.9 重复性试验

取同一批号样品（批号20111125）五份，按上述条件，平行处理并测定（n=2）。结果，RSD=0.95%(n=5)，表明本方法重复性好。

3.10 回收率试验

精密称取已知含量为1.1373mg/g（批号20111125）样品约0.2g，共六份，分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液（0.1025mg/mL）2mL，即0.2050mg，再加入稀乙醇18mL，按上述含量测定项下的方法测定含量，结果见表2。结果表明，本方法加样回收率好（样品进样量约为0.22μg，在线性范围内）。

表2 回收率测定结果（n=6）

3.11 样品含量测定

取10 批样品，分别按＂3.2＂项下方法制成供试品溶液，照上述色谱条件测定，并计算淫羊藿苷的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n=10）

4 讨论

供试品溶液的制备，本品用稀乙醇为提取溶媒进行超声提取，现对超声提取时间进行考察，结果表明：超声处理15 分钟时，样品中的淫羊藿苷提取不完全，超声处理30 分钟与45 分钟时，其含量相当，均可将样品中的淫羊藿苷提取完全，因此确定超声处理时间为30 分钟。参照中国药典2010年版一部淫羊藿项下淫羊藿苷的含量测定方法，对本品中淫羊藿苷的含量进行测定，试验结果表明，缺淫羊藿的阴性溶液无干扰，且样品分离效果好。经方法学考察，本含量测定方法结果较好，方法可行。经测定十批成品，片重0.4 克，其淫羊藿苷平均含量约为0.45 mg/片，按约80%折算，暂规定本品每片中含淫羊藿苷不得少于0.36mg。

[1]国家中成药标准汇编，内科肾系分册「S」.北京：人民卫生出版社，2002：876.

[2]刘克敏，刘振玉.黄芪的药理作用及其在运动医学中的应用「J」.现 代中 西 医 结 合 杂 志,2005,14 (17)：2346-2347 -2349.

[3]陈营镑，刘峰.淫羊藿的研究进展「J」.陕西中医,2001,22(10)：46.

[4]吕武清主编.中成药中的药材薄层色谱鉴别「M」.人民卫生出版社，1997：288,521.

[5]中华人民共和国药典（2010 版），一部「S」.2010 ：附录32.