促排卵联合PureceptionTM 密度梯度法优选精子在AIH中的应用

柒铭铭，凌国灿，周建萍

(湖南省株洲市一医院妇产科生殖中心,湖南 株洲 412000)

夫精人工受精(AIH)是将丈夫的精液经洗涤、上游或离心等方法处理后去除精浆中抑制受精的物质、前列腺素、免疫性细胞和抗精子抗体等,优选提取高活力的精子注入女方子宫腔内以获得妊娠的助孕技术,同时女方可促排卵治疗以增加排卵数量,从而提高妊娠率。

精子的优选是该技术的关键环节之一,精子优选的方法主要有上游法和密度梯度离心法,所用的精子处理液也各不相同,现对我院行AIH 治疗的不孕症患者的病例资料进行回顾性分析,探讨PureceptionTM 密度梯度离心法联合促排卵治疗的AIH临床妊娠率。

1 材料与方法

1.1 研究对象

一般资料2008年12月～2012年12月在我院行AIH 治疗的不孕患者59例共113 周期,其中原发性不孕24例,继发性不孕35例,患者年龄25.7～42.3 岁,平均年龄32.7 岁,不孕年限2～17年,平均5.6年,不孕原因包括：排卵异常（6例），轻度少弱精症（30例），精液不液化或液化不全(12例)，免疫性不孕(5例），性功能障碍(3例），宫颈因素(3例），在行IUI 治疗前，按WHO 标准对男方精液分析2～3次，女方无全身性疾病及传染病，行子宫输卵管碘油造影或腹腔镜下通液检查,至少一侧输卵管通畅。

1.2 方法

1.2.1 标本收集

禁欲3～7天后留取精液于无菌取精杯中,标记患者夫妇姓名，待精液完全液化后按WHO（第四版）《人类精液及精子--宫颈精液实验室检验手册》标准进行精液分析，用Macro 精子计数板手工法计数精子数量。

1.2.2 精子处理方法

①取40%和80% Pureception 液各1mL,预热至37℃。②在2095 离心管内，依次放入80%和40% Pureception 液各1mL,注意不要扰乱两层的界面。③在40%Pureception 液上方放入1～2mL 液化精液,如精液粘稠度较高，先将精液和HTF-HEPES以1：1 混合。④离心300g 20～30 分钟。⑤小心移去精液和Pureception 液，如精子小丸不明显或较小,留下80% Pureception 液0.5～1.0mL,加入2～3mL 含5mg/mL的HIF-HEPES，混匀。⑥离心150g 10 分钟。⑦悬浮精子小丸在2mL的含HSA 5mg/ml的HTF-HEPES中，离心150g 10 分钟。⑧如精子小丸很紧，小心移去所有上清液,如果精子小丸不明显或较小，移去大部分上清液,加入0.5～1.0ml 含5mg/mL的HIF-HEPES 混匀，待用。

1.2.3 超促排卵方法

1.2.3.1 促卵泡发育方案

①克罗米芬(CC)：为我院诱导排卵中最常用的药物,剂量50～100mL/d,最大剂量≤150mg/d，于月经周期第5天开始连服5天。②尿促性腺素(HMG)：采用丽珠制药厂生产的人绝经期促性腺激素,每支含促卵泡生成素(FSH) 及促黄体生成素(LH)各75IU，以刺激卵泡发育,于绝经第三天开始用药,根据患者的敏感性，每天应用75～225IU，监测卵泡大小与血雌二醇水平以调整促性腺激素的剂量，连用5～7天。③CC+HMG：当CC 治疗二个或者三个周期,用B 超监测卵泡生长发育缓慢或停止生长者，我们常采用CC+HMG，促进卵泡生长。④来曲唑(LE)：剂量2.5mg～7.5mg，月经第3～7天。

1.2.3.2 卵泡监测及宫腔内人工受精

月经第8天开始经阴道监测卵泡大小，内膜情况，最大卵泡直径达18mm 时给予注射人绒毛膜促性腺素(HCG)5000～10000IU，24～26 小时后进行宫腔内人工授精(IUI)，用一次性IUI 管轻柔置入宫腔内口上方约1cm 处,将处理后的精液约0.5mL 缓慢注入宫腔内，部分于宫颈管内，取出导管后抬高臀部卧床休息30 分钟。

1.2.3.3 黄体支持

从AIH 日开始每3d 肌注HCG2000U/次×5次，黄体功能不足者，IUI 后可肌注黄体酮20～40mg/d，从AIH 日开始，共16天至验血β-HCG。

1.2.3.4 妊娠的诊断AIH 后16d 检测血β-HCG,AIH 后35d 行B 超检查，有妊娠囊或者原始心管搏动，或流产，异位妊娠经病理学检查证实妊娠者，确定为临床妊娠。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.5 软件进行数据分析,计量资料用mean±SD表示,组间率的比较采用χ2 检验，组间均数的比较用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PureceptionTM 密度梯度离心法对处理精液的影响

采用PureceptionTM 密度梯度离心法对患者精液的洗涤处理，结果表明，精液洗涤后比较洗涤前在精子密度、活动率、a+b 级活动数有显著性提高，畸形率下降，有统计学意义（表1）。

表1 精液洗涤前后结果的平均数对比

2.2 促排卵方案对妊娠率的影响

去除后三组方案，应用例数较少，去除后，比较其他2组，处理采用χ2 检验，两两比较，采用促排卵方案的排卵周期妊娠率高于自然周期妊娠率,差异有显著性,但四种促排卵方案妊娠率无明显差异（表2）。

表2 促排卵方案与妊娠率

2.3 自然周期与促排卵周期妊娠结局分析

本研究表明，促排卵周期成熟卵泡数多于自然周期，促排卵周期妊娠率明显高于自然周期，有统计学意义（表3）。

表3 一般情况及妊娠结局分析

3 讨论

本文采用PureceptionTM 密度梯度离心法进行优选精子，选用的介质PureceptionTM 是以PurespermTM的基础加上HEPES 缓冲的HIF 或者Ham'sF-10[1]。将获得精子悬液用于宫腔内人工授精，结果显示，132 份精液处理后精子密度、活率较处理前明显提高,而畸形精子产生机率明显降低，白细胞及细胞碎片等非精子成分明显减少，达到了优选的效果，将获得的精子悬液用于AIH，周期临床妊娠率为15.07%，表明采用PureceptionTM 密度梯度离心法优选精子应用于AIH 可获得满意的临床妊娠率，是一种较好的AIH 前精子处理方法，这一结论符合不同精子优选方法对优质精子回收率的研究。

密度梯度离心法的缺点是回收的精子活动率较上游法低,且对于精子密度＜5×109/L。逆行射精的精液质量,密度梯度离心法并不完全适合[2]。但因进行AIH 治疗的患者精液质量绝大部分为轻-中度精液异常，所以PureceptionTM 密度梯度离心法是一种较合适临床广泛使用的优化精子方法。

人工授精可在自然周期或药物促排卵周期进行,对于排卵正常而男方因素导致不育,可行自然周期人工授精。对于不明显原因性不孕、免疫性不孕、轻度子宫内膜异位症等造成的不孕最好在促排周期行AIH。本研究表明，促排卵周期与自然周期相比较，临床妊娠率差异有显著性,采用促排卵药物的患者，有更高的妊娠率，应用不同促排卵药物的妊娠结果，以HMG和LE 最高，采用HMG 妊娠率高于CC。枸橼酸克罗米芬为最常用的促排卵药物，兼有雌激素和抗雌激素的作用,其作用有赖于下丘脑-垂体-卵巢轴正负反馈机制的完整性,但有研究显示克罗米芬会降低子宫内膜对胚胎的容受性或导致自然流产率上升[3]。尿促性腺素在卵泡发生过程中启动卵泡的募集和生长,选择优势化成熟,增加雌激素的水平和促进子宫内膜的增值[4]。来曲唑是一种芳香化酶抑制剂,可抑制雄激素转化为雌激素,解除雌激素对垂体的负反馈抑制,刺激FSH 分泌,诱导卵泡生长发育排卵,于1999年首次用于促排卵治疗，目前，有研究认为来曲唑可作为一线临床促排卵药物[5]。

本研究80 个促排卵周期中,44 个CC 周期,8个CC+HMG 周期,14 个HMG 周期,14 个LE 周期,临床妊娠率有明显差异。Dankert 等在一个不明原因不孕和和男性因素AIH的随机研究中发现HMG.CC 两组患者促排卵后的卵泡数。临床妊娠率均比自然周期增加,但两组无明显差异[6],由于CC相对于HMG 经济方便,对卵巢的刺激作用较弱,发生OHSS的风险小,可作为一线用药。促排卵增加AIH 妊娠率的机制尚不清楚,多数学者认为卵泡的数目与妊娠结局有关。本研究发现卵泡数与AIH临床妊娠率有关,多卵泡发育周期妊娠率高于单卵泡发育,但妊娠率无统计学差异，提示促排卵增加妊娠率的机制改善了子宫内膜的形态和功能,克服潜在的卵泡发育或排卵异常有关。总之,促排卵并不适合所有的AIH 周期,但对于子宫颈因素,不明原因不孕行人工授精夫妇联合促排卵可能提高周期妊娠率[7]。

综上所述,我们认为促排卵联合PureceptionTM密度梯度离心法治疗不孕症操作简单,患者痛苦小,设备相对简单,便于推广。

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