HPLC-ELSD用于羊胆粉中胆酸及甘氨胆酸的测定研究

石 岩，孙冬梅，熊 婧，魏 锋，马双成，林瑞超＊ （沈阳药科大学中药学院，沈阳 006； 中国食品药品检定研究院； 吉林市食品药品检验所）

动物胆汁作为药用已有数千年的历史［1］，较为常用的为牛黄、熊胆、牛胆、猪胆和羊胆等。羊胆粉来源于牛科动物山羊CaprahircusL.或绵羊OvisariesL.的胆囊胆汁，具有清火、明目、解毒和抗炎等功效［2－4］。目前，关于羊胆粉中的成分测定研究的报道不多，缺乏对其主要胆酸类成分胆酸 （cholic acid，CA）及甘氨胆酸 （glycocholic acid，GCA）的测定研究［1，5］。CA是胆汁类药材中重要的药效成分，研究相对较多，而GCA作为一种结合型胆酸则研究相对较少，其对慢性炎症有较强的抑制作用［6］，并且可提高非特异性免疫功能，增强机体体液免疫能力［7］。由于CA和GCA均缺少共轭结构，因此紫外吸收较弱，使用传统的紫外检测器 （UV）进行检测难以获得满意的结果，而蒸发光散射检测器 （ELSD）作为通用型质量检测器往往可以填补UV的不足［8］。目前，关于羊胆汁类药材的标准较少，仅有的 《福建省中药材标准》（2006）中 “羊胆膏”标准也缺少含量测定项［9］。本文基于高效液相色谱仪与ELSD联用对羊胆粉中CA和GCA进行了测定研究，建立的方法可同时测定羊胆粉中CA和GCA的含量，色谱条件简便，易操作，并且分离情况良好，可以用于羊胆粉的质量评价与控制。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪；Alltech ELSD 2000ES蒸发光散射检测器。

CA对照品 （批号：100078-200414，供含量测定用；中国食品药品检定研究院）；GCA对照品（批号：212-730-9，含量＞98%；东京化成株式会社）。羊胆粉样品3批 （均为屠宰场收购得到，阴干后打粉）。甲醇、甲酸均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为Milli-Q超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱 柱：Wondasil C18 （4.6mm×250mm，5μm）；柱温：25℃；流速：1.0mL·min－1；进样量：10μL；ELSD检测器氮气流速：2.3L·min－1，漂移管温度：110℃；流动相A为0.2%甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱 （0～7min，5%B；7～15min，5%→80%B）。色谱图见图1。

图1 羊胆粉HPLC色谱图

2.2 混合对照品溶液的制备

分别取CA和GCA的对照品适量，加甲醇制成CA和GCA浓度均约为80μg·mL－1的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末约20mg，精密称定并置于锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称重，超声 （功率：250W，频率：25kHz）20min，甲醇补重，过滤，即得。

2.4 线性关系考察

对 “2.2”项下混合对照品溶液加甲醇进行不同比例的稀释，制成线性系列混合对照品溶液。精密吸取各级混合对照品溶液各10μL，按 “2.1”项下色谱条件，注入液相色谱仪，测得峰面积，以峰面积常用对数值Y为纵坐标，进样量 （μg）常用对数值X为横坐标，计算CA和GCA的线性回归方程：

YCA＝1.771X＋2.896r＝0.9998

YGCA＝1.599X＋2.833r＝0.9997

结果表明CA和GCA分别在0.163～0.817μg和0.160～0.801μg之间线性关系良好。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，按 “2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算得CA和GCA峰面积的平均值分别为93.35656和110.65887，RSD分别为0.9%和0.4%，结果表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取1号供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件分别于0～12h，每隔2h进样1次，测定峰面积，计算CA和GCA峰面积的平均值分别为94.89165和109.31953，RSD分别为1.2%和1.8%，结果表明样品溶液在12h内稳定。

2.7 重复性试验

取1号样品6份，按 “2.3”项下方法分别平行制备供试品溶液，依 “2.1”项下色谱条件测定含量，计算得CA和GCA的平均含量分别为5.3%和6.7%，RSD分别为1.5%和1.9%，表明本法重复性良好。

2.8 回收率试验

取已知CA和GCA含量的1号样品6份，每份约10mg，精密称定后分别精密加入 “2.2”项下制备的混合对照品溶液10mL，再精密加入甲醇15mL，称重，超声处理 （功率：250W，频率：25kHz）20min，甲醇补重，过滤，按 “2.1”项下色谱条件测定，计算CA和GCA的平均回收率（n＝6）分别为103.2% （RSD＝1.7%）和101.2%（RSD＝1.3%），见表1，表明本法回收率良好。

表1 加样回收率测定结果

2.9 样品测定

用上述方法对3批羊胆粉样品进行了测定，通过标准曲线计算得到各批样品中CA和GCA的含量，见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

本试验在初始阶段考察了样品超声提取的时间，结果发现超声20min后，供试品溶液中CA和GCA的含量已达最大值，因此选择超声时间为20min。此外还对高效液相色谱的流动相进行了考察，发现使用0.2%甲酸和乙腈流动相系统，色谱峰的峰形较好，保留时间也较合适，因此选用了该流动相系统。

有文献报道胆汁中游离胆酸类和结合胆酸类成分的含量高低与胆汁的新鲜程度有关［10］，羊胆粉是羊胆汁干燥后的粉末，因此本文所测得的CA和GCA含量可以反映其原料羊胆汁的新鲜程度，可以很好地表征和评价羊胆粉的质量。

［1］张贇华，刘建忠，彭霞，等.HPLC法比较熊胆粉及猪胆粉、牛胆粉、羊胆粉和鸡胆粉中胆汁酸类成分 ［J］.药物分析杂志，2009，29 （3）：487-490.

［2］赵文静，蒋蕾，旺建伟.羊胆汁抗急性炎症作用与PGE2含量变化相关的实验研究 ［J］.中医药信息，2009，26（5）：50-52.

［3］李慧峰，李培峰，赵珍.羊胆汁中甘氨胆酸提取工艺研究［J］.安徽农业科学，2008，36 （20）：8415，8464.

［4］赵文静，蒋蕾，旺建伟.羊胆汁对炎症介质含量影响的实验研究 ［J］.四川中医，2010，28 （1）：32-33.

［5］鞠爱华，荀雅书，苏秀兰，等.蒙药牛胆粉与羊胆粉中胆酸类成分的分析测定 ［J］.光谱学与光谱分析，2008，28（3）：645-647.

［6］李慧峰，李培锋，关红，等.甘氨胆酸抗炎作用的研究［J］.内蒙古农业大学学报，2006，27 （2）：5-8.

［7］李培锋，赵珍，关红，等.甘氨胆酸对小鼠免疫功能的影响［J］.中国兽医杂志，2007，43 （10）：6-8.

［8］邓海根，曹雨震.高效液相色谱仪的通用型质量检测器—蒸发光散射检测器 （ELSD） ［J］.药物分析杂志，1994，14（3）：61-63.

［9］福建省中药材标准 ［S］.2006：103-104.

［10］张启明，吴健敏，严克东，等.牛胆粉和羊胆粉中胆汁酸的含量测定 ［J］.中国生化药物杂志，1993，64 （2）：44-46.