碱性成纤维细胞生长因子凝胶的无菌检查

丁有学，刘 兰，毕 华，史新昌，饶春明＊ （中国食品药品检定研究院，北京 00050； 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室）

碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）凝胶用于烧伤创面，体表慢性溃疡创面及外伤、手术伤等新鲜创面的愈合，因此bFGF凝胶须为无菌制剂。《中国药典》2010年版三部规定，凡要求无菌的生物制品均需进行无菌检查；当建立产品的无菌检查法时应进行方法学验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查；若该产品的组分或检验条件发生改变时，检查方法应重新验证［1］。这与 《中国药典》2010年版二部、欧洲药典及美国药典的要求相同［2－4］。生物技术药物多为小容量注射剂产品且不允许添加抗菌素及防腐剂，无菌检查通常采用薄膜过滤法。bFGF凝胶中含有大量的赋形剂、保护剂、防腐剂等，不能通过0.45μm滤膜，因此选择直接接种法对其进行无菌检查并进行了方法学验证。

1 材料与方法

1.1 设备

生物安全柜，超净工作台，生化培养箱 （20～25℃、30～35℃），高压灭菌器。

1.2 培养基及试剂

硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基均由中国食品药品检定研究院培养基室提供；标准比浊管由中国食品药品检定研究结核病疫苗室提供；0.9%氯化钠注射液 （石家庄四药有限公司）；灭菌0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液为本实验室自制。

1.3 菌种

金黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcusaureus）［CMCC （B）26003］、铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） ［CMCC （B）10104］、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis） ［CMCC （B）63501］、生孢梭菌（Clostridiumsporogenes） ［CMCC （B）64941］、白色念珠菌 （Candidaalbicans） ［CMCC （F）98001］、黑曲霉 （Aspergillusniger） ［CMCC （F）98003］，均来自中国食品药品检定研究院国家菌种保藏中心。

1.4 供试品

碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）凝胶（5g·支－1，批 号：20090901、20090902、20090903）由企业提供。

1.5 方法［1－2］

1.5.1 菌液的制备

分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物200μL置10mL营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物200μL置10mL硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物200μL置10mL改良马丁培养基中，20～25℃培养24～48h，上述培养物用0.9%氯化钠溶液配制成每1mL含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物200μL置改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养5～7d，加入3～5mL无菌的含0.05% （mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液置无菌试管内，用无菌的含0.05% （mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液配制成每1mL含孢子数小于100cfu的孢子悬液。细菌计数可采用比浊法［5－6］，与标准比浊管对照，根据中国细菌浊度标准使用说明书参考菌数表将菌液稀释，同时进行平板计数。

1.5.2 方法学验证

取碱性成纤维细胞生长因子凝胶供试品 （批号：20090902）10支，全部加至100mL 0.9%无菌氯化钠注射液中，充分搅拌，使凝胶完全溶解于氯化钠溶液中，保证供试品的均一性，作为供试液。取200mL·瓶－1的硫乙醇酸盐流体培养基8瓶，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2瓶，取200mL·瓶－1改良马丁培养基4瓶，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2瓶。将以上接入各种菌液的培养基中的1瓶接入供试液，每瓶10mL，作为供试品组；另1瓶不加供试液作为阳性对照组；同时另取硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各1瓶，作阴性对照，细菌置30～35℃培养3～5d，真菌置20～25℃培养3～5d，逐日观察各瓶内试验菌的生长情况。

1.5.3 无菌检查

3批供试液的配制同方法学验证。每批供试品取硫乙醇酸盐流体培养基8瓶、改良马丁培养基4瓶，各200mL·瓶－1（2种培养基接种瓶数比例为2∶1），每瓶接种供试液10mL；另取硫乙醇酸盐流体培养基2瓶、改良马丁培养基1瓶，接入0.9%无菌氯化钠注射液10mL，作为阴性对照；将以上硫乙醇酸盐流体培养基平均分成2份，其中1份置30～35℃培养，另1份和改良马丁培养基共同置20～25℃培养14d，培养期间逐日观察并记录是否有菌生长。

1.5.4 阳性对照

无菌检查的同时做阳性对照。取硫乙醇酸盐流体培养基1瓶，接入供试液10mL，接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌1mL，置30～35℃培养48～72h。

2 结果

2.1 菌液制备结果

各菌液经相应条件培养后，细菌生长状态良好，计数结果见表1。

表1 细菌计数结果

2.2 方法学验证结果

方法学验证的各试验瓶经相应培养条件培养后结果见表2。从表2可以看出，各供试品组与阳性对照组细菌生长速度一致，金黄色葡萄球菌等4菌株组均在24h即可观察到细菌生长，白色念珠菌和黑曲霉两组细菌生长较慢，各培养瓶均

在第2d可以观察到细菌生长，说明该条件下供试品无抑菌作用或抑菌成分可忽略不计，可用于碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）凝胶的无菌检查。

2.3 无菌检查结果

无菌检查试验经14d培养后，阴性对照组与3批供试品均无菌生长，阳性对照经3d培养细菌生长良好。

表2 方法学验证结果

3 讨论

《中国药典》2005年版三部无菌检查法项下没有关于方法学验证的要求，因此很多生产和检验机构均未进行生物制品无菌检查的方法学验证，《中国药典》2010年版三部增加了这部分内容。新版药典的实施给实验人员在实验操作上带来了一些困难，本实验室在几年前开展了这方面的研究工作，现将一些体会总结如下，希望能为同行提供参考。

（1）在菌液制备过程中，细菌的生长速度与接种活菌数量有很大关系。因此，应注意观察各菌生长状态，在实验人员经验不足的情况下，细菌计数应采用平板计数法，以保证菌液浓度在10～100cfu·mL－1之间［5－6］，建议最好控制在50cfu·mL－1左右［7］。适宜的菌液浓度是方法学验证的关键，细菌的生长速度过快或过慢，均不利于观察供试品的抑菌情况，有可能出现假阴性结果。

（2）菌液的制备、验证试验和阳性对照试验应在有独立排风的阳性实验室进行，而不能在供试品的无菌检查实验室进行，以避免污染无菌操作环境。试验后废弃的阳性菌应尽可能原位灭菌。试验菌株传代不能超过5代 （从菌种保藏中心获得的冻干菌种为0代），以保证其生物学特性。

（3）在建立生物制品的无菌检查方法时，应优先采用薄膜过滤法。因为薄膜过滤法通过冲洗可以最大限度地降低抑菌成分的作用，比其他方法更加灵敏［8］。当薄膜过滤法无法操作时再考虑采用直接接种法。直接接种法的最大缺点是所有成分都在培养基中一起培养，供试品浓度高时会影响培养基的澄清度，无法观察结果［9］；增加稀释度又会造成供试品体积过大。为了保证接种量必须加大培养基用量，造成不必要的麻烦和浪费，掌握好适当的稀释度是无菌检查试验有效性的必要保障。

（4）在方法学验证的过程中，应每天密切观察各试验管细菌生长情况。如果供试品组与试验菌组细菌生长速度不一致，考虑可能是供试品中的抑菌因素没有被完全消除。此时应增加稀释倍数，直至两组试验管细菌生长速度相同。应特别强调的是，在无菌检查试验时，供试品的稀释方法必须与验证的方法保持一致。

［1］中国药典 ［S］.三部，2010：附录Ⅻ.

［2］中国药典 ［S］.二部，2010：附录Ⅺ H.

［3］EP7.0 ［S］.02methods of analysis：140 2.6.1，Sterility 153-155.

［4］USP30-NF25 ［S］.General Test and Assays：Microbiologica Test：71SterilityTests.

［5］中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［M］.北京：中国医药科技出版社，2005：313-323.

［6］纪绍梅，严德喜.微生物培养基质控与图解 ［M］.北京：北京科学技术出版社，2006.

［7］江志杰，刘文杰，高春，等.左氧氟沙星注射液无菌检查方法验证 ［J］.中国药品标准，2008，9 （4）：245-247.

［8］吴菊华，张树梅.直接接种法与薄膜过滤法在小容量注射剂无菌检查中的应用比较 ［J］.中国交通医学杂志，2005，19（2）：152-153.

［9］丁有学，毕华，刘兰.细胞因子的无菌检查法 ［J］.中国药事，2010，24 （6）：600-601.