丹参注射液生物活性限度测定方法适用性研究

刘 倩，陈 晨，张 媛，吴彦霖，高 华（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

丹参注射液为丹参经水提醇沉等步骤制成的单方中药注射剂，可扩张血管、增加冠状动脉血流量，对缺血或损伤的心肌亦有促进和恢复等功效。具有活血祛瘀、通脉养心的功能。广泛应用于心绞痛、心肌缺血、急性心梗等心脑血管疾病［1－3］。临床用法用量为肌内注射、静脉注射或静脉滴注。其中静脉滴注为一次10～20mL，一日1次，用5%葡萄糖注射液100～500mL稀释后使用。本试验依据该药的功能主治和药理作用，进行了质量标准生物活性测定方法的初步探索。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AggRAM血小板聚集仪 （美国海伦娜公司）；十通道血凝仪 （德国Merlin公司）。

1.2 试药

丹参注射液 （3个厂家，3个批次）。盐酸川芎嗪注射液 （北京市永康药业有限公司，规格：2mL∶40mg，批号：09100201）；胶原蛋白 （Worthingtong公司：Bovine Achilles Tendon，规格：10gm，批号：35E8048-E）；盐酸肾上腺素 （北京市永康药业有限公司，规格：1mL∶1mg，批号：10020241）；氯化钠注射液 （石家庄四药有限公司，规格：100mL∶0.9g，批号：081221161）；ADP （Helena Laboratories Beaumont，批号：2-10-551189）；枸橼酸钠 （柠檬酸三钠，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080202）；APTT试剂盒 （南京都莱生物技术有限公司，批号：Y115025）。

2 方法与结果

2.1 实验动物

KM小鼠，雄性，体重 （18～22）g，SPF级；大耳白兔，雄性，体重2.5kg，SPF级。均由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供，许可证号：SCXK （京）2005-0004。

2.2 抗小鼠体内血栓形成试验［4］

取成年健康雄性KM小鼠50只，随机平均分为模型组、阳性对照组，以及3组实验样品组。其中模型组给予生理盐水，阳性对照组给予以氯化钠注射液稀释的浓度为0.1334mg·kg－1的盐酸川芎嗪溶液，依据 《中药生物活性测定指导原则》，实验样品组采用临床人用30倍剂量，即按照注射液含生药0.5g·mL－1、每日最大用量0.333mL·kg－1折算，给予注射液10mL·kg－1，生药浓度为5g·kg－1。各组均于每日上午9时腹腔注射给药，连续3d，各组给药体积均为0.2mL/10g，各组动物均于第3d给药30min后，尾静脉注射血栓诱导剂 （含胶原蛋白0.60mg·mL－1-肾上腺素0.02mg·mL－1，0.1mL/10g）造成小鼠体内血栓模型，注射后立即观察记录小鼠未偏瘫个数及15min小鼠偏瘫恢复的个数，采用卡方检验 （准确概率法）进行统计。实验样品组与模型组比较，抗小鼠体内血栓形成的保护率增加，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。见表1。

造模后小鼠保护率的计算公式：

表1 丹参注射液对小鼠体内血栓的药效学研究（n＝10，±s）

表1 丹参注射液对小鼠体内血栓的药效学研究（n＝10，±s）

注：与模型组比较：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别 小鼠未偏瘫个数＋小鼠15min恢复个数 P值 保护率（%）模型组0.00阳性组 7 0.003 70.00＃＃厂家 A 6 0.011 60.00＃厂家B 5 0.033 50.00＃厂家C 7 0.003 70.00 0＃＃

由表1可知，阳性组磷酸川芎嗪作用与模型组比较，小鼠未偏瘫个数与小鼠偏瘫恢复个数增多，在统计学上有显著性差异。3个厂家的丹参注射液与模型组相比，小鼠未死亡数以及15min恢复个数增多，且在统计学上有显著性差异，表明它们均对胶原蛋白－肾上腺素诱导的急性血栓均有显著的保护作用。

2.3 家兔体外聚集试验［5］

家兔心脏取血，以3.8%枸橼酸钠抗凝 （血液与抗凝剂之比为9∶1）。制备富血小板血浆 （PRP）和贫血小板血浆 （PPP）：1000r·min－1离心10min，取上清液即为PRP，余下部分再以3000r·min－1离心10min，取上清液，即为PPP，制备好后3h内使用。实验分为模型组、阳性对照组及3组实验样品组，每组平行做3次实验。其中模型组给予生理盐水，阳性对照组给予盐酸川芎嗪注射液原液，实验样品组均给予丹参注射液原液。打开血小板聚集仪，预热30min后，先用200μL PPP空白设置100%聚集，加入PRP 200μL及一定浓度的待测药物20μL，37℃恒温及搅拌条件下加入ADP诱导剂50μL，记录5min内血小板聚集曲线及最大聚集率。药物对血小板聚集的抑制率计算公式：

表2 丹参注射液体外抗血小板聚集的药效学研究 （n＝3，±s）

表2 丹参注射液体外抗血小板聚集的药效学研究 （n＝3，±s）

注：与模型组比较：＃＃P＜0.01。

组别 最大聚集率（%） 聚集抑制率（%）模型组 56.0±0.7 0阳性组 17.8±4.2＃＃ 23.1厂家 A 28.5±5.0＃＃ 49.0厂家B 28.6±2.4＃＃ 48.9厂家C 43.1±3.7＃＃68.2

由表2可知，阳性组盐酸川芎嗪作用与模型组比较，血小板最大聚集率明显减少，在统计学上有显著性差异。3个厂家的丹参注射液与模型组相比，血小板最大聚集率均明显减少，且在统计学上有显著性差异，表明它们对ADP诱导的家兔血小板聚集均有抑制作用。

2.4 兔血浆活化部分凝血活酶时间 （APTT）试验［6］

家兔心脏取血，以3.8%枸橼酸钠溶液 （1∶9）抗凝，2500r·min－1离心10min后，取上清液得PPP。取50μL PPP置血凝仪样品杯，加入稀释一倍的丹参注射液50μL，对照管加入等体积的生理盐水，再加入APTT试剂50μL，混合摇匀，37℃准确预温180s后，加入50μL CaCl2试剂，立即启动仪器进行自动测试并记录凝血时间。每组平行做3次实验。药物凝血时间延长率的计算公式：

实验结果以均数±标准差 （x±s）表示；实验数据统计采用SPSS 11.15软件中的one way－ANOVA完成。见表3。

表3 丹参注射液对兔血浆活化部分凝血活酶时间 （APTT）的影响 （n＝3，±s）

表3 丹参注射液对兔血浆活化部分凝血活酶时间 （APTT）的影响 （n＝3，±s）

注：与阴性对照组比较：＊＊P＜0.01。

组别 凝血时间（min） 凝血时间延长率（%）阴性对照组17.0±0.7 0厂家 A 53.8±2.5＊＊ 217厂家B 36.1±2.8＊＊ 112厂家C 51.8±3.7＊＊205

由表3可知，与阴性对照组相比，3个厂家的丹参注射液均可明显增加凝血时间，且在统计学上有显著性差异，表明它们对血浆活化部分凝血活酶时间均有延长作用。

3 讨论

3.1 丹参注射液生物活性测定方法的选择

丹参注射液是国家基本药物品种，收载于 《卫生部药品标准·中药成方制剂》第20册。药理研究表明，水溶性酚酸类成分是丹参注射液发挥活血化瘀功效的主要成分。现行标准采用高效液相色谱法测定原儿茶醛的含量 （不得少于0.2mg·mL－1），但与其有效性间的关系尚难确定。因此，用生物活性测定方法来评价产品的有效性可以作为理化测定方法的补充，以达到综合控制产品质量的目的。

3个厂家的样品对ADP诱导的家兔体外血小板最大聚集率均有明显的抑制作用，并且可以延长血浆活化部分凝血活酶时间，表明该药对家兔血小板聚集活性有一定的抑制作用。2种体外试验的结果与小鼠体内血栓形成试验结果具有一定的相关性和相似性。其中就精密度高、操作简单和成本低廉而言，体外方法优于体内方法。但体内试验接近于临床，小鼠体内血栓形成试验模型因每批动物的个体差异及血栓诱导剂批次间的差异会造成出现栓塞的概率产生波动，故建议在采用该模型时应注意选择体重在20～22g的动物、调整血栓诱导剂的剂量，以保证模型组动物出现偏瘫概率超过80%，方可用于生物活性试验。

用上述3种试验方法对3个厂家的丹参注射液进行生物活性测定，结果表明，丹参注射液确有与其活血祛瘀、通脉养心相关的生物活性。不同方法对3个厂家的样品测定的结果有一定的差异，如厂家C的样品，其抑制血栓形成和抑制血小板聚集作用强于其他2批样品，而APTT试验则弱于厂家A，研究结果表明，不同厂家的样品间既有作用方式的差异，又有作用强度的差异。

3.2 丹参注射液生物活性测定方法的适用性

上述3种试验方法中，建议3种方法即1种体内试验和2种体外试验 （体外血小板聚集试验或APTT法）均可作为丹参注射液质量标准中的生物活性测定方法，以5g生药kg－1（为临床最大用量的30倍）或合适的剂量作为限值剂量，但考虑到中药注射剂的复杂性和生物活性测定方法的局限性，建议3种方法中任选1种方法测定结果阳性即可判断为合格。若结果为阴性时需加做另2种方法，复试结果必须均为阳性后才能判断为合格。如复试仅有1种方法为阳性，判断为不合格。

生物活性测定方法对丹参注射液质量标准的适用性，还应有生产企业对该产品进行质量内控检验验证的数据［7］。经过验证，进一步确证该产品对方法和限值的适用性，由于中药制剂过程的复杂性，在质量标准内控测定时，相同产品也可采用不同的方法和限值积累测定数据，待制定正式标准时再进行统一。

［1］刘娟，刘颖.丹参药理活性成分研究进展 ［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12 （7）：15-17.

［2］王珪蓉.丹参注射液的药理作用与临床研究进展 ［J］.现代医药卫生，2006，2 （10）：1473-1474.

［3］许亚萍，伍旭明.丹参注射液治疗心血管疾病的研究进展［J］.中国药业，2012，21 （6）：90-91.

［4］陈晨，刘倩，张媛，等.红花注射液生物活性测定方法的筛选 ［J］.药物分析杂志，2013，33 （1）：12-17.

［5］刘倩，陈晨，戴忠，等.红花注射液有效成分的确定及不同厂家中量效关系的比较 ［J］.药物分析杂志，2012，32（7）：1158-1161.

［6］王碧松，王志斌，高阳，等.血凝仪-APTT法测定肝素的效价 ［J］.药物分析杂志，2012，32 （7）：1154-1157.

［7］芮菁，张月玲，李元静，等.灯盏细辛注射液生物活性限度测定方法适用性研究 ［J］.中国药品标准，2010，11 （2）：95-99.