纳豆芽孢杆菌次生代谢产物抑菌功能的研究

王继伟 葛英亮 于 晋 吉亚力 谢玉锋

（1.哈尔滨学院工学院食品科学与工程系，黑龙江 哈尔滨 150080；2.哈尔滨师范大学管理学院，黑龙江 哈尔滨 150090）

食品生物抑菌剂本身即为食品的组成成分，所以具有安全、高效、价廉的特点［1］，是纯绿色生态制剂［2］，具有很好的发展前景［3］。目前，在食品中常用的生物抑菌剂主要为乳酸链球菌素（nisin）和那他霉素（natamycin），抑菌效果好，生产成本较高，应用不够广泛。纳豆芽孢杆菌 （Bacillus natto）属于芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌［4］，通常为（0.7～0.8）μm×（2.0～3.0）μm，革兰氏阳性菌，其芽孢呈椭圆形或柱状，适宜在中性或偏酸性环境中生存［5］，该菌有鞭毛，能运动。纳豆芽孢杆菌是有益菌，耐酸，在胃酸下4h存活率为100%［6］，同时具有强力的病原菌抑制能力［7］，是各种有益菌当中对环境耐受力最好的菌种之一［8］。含有纳豆芽孢杆菌的食品，可抵抗胃酸等物质的杀灭作用，进入小肠，能改变人体肠道菌丛生态，调节肠道菌群，帮助消化道机能正常化［9］，同时增强动物细胞免疫反应［10］。关于纳豆芽孢杆菌代谢产物抑菌功能的研究［11－13］已经逐渐开始，纳豆芽孢杆菌次生代谢产物中可能含有2，6－吡啶二羧酸、杆菌肽、多粘菌素等物质，对食品中常见的污染菌和致病菌具有很强的抑菌效果［14］。

本试验拟从纳豆中筛选分离纳豆芽孢杆菌，发酵提取次生代谢产物，研究该代谢产物对食品中常见的污染菌及致病菌的抑菌效果，为开发新型的食品生物抑菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纳豆：食品级，哈尔滨日尚食品有限公司、黑龙江鑫东方食品有限公司；

牛肉膏：北京圣伦食品有限公司；

蛋白胨：山东梁山科鑫生物制品有限公司；

葡萄糖：分析纯，上海西王淀粉糖有限公司；

KH2PO4、K2HPO4：分析纯，武汉南轻科技有限公司。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1 000mL，pH值7.4～7.6；

马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，自来水1 000mL。

1.3 仪器与设备

电子天平：FA2204B型，上海精密科学仪器有限公司；

生化培养箱：LHR系列，上海一恒科技有限公司；

摇床培养箱：BS－1E型，苏州威尔实验用品有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ－LS－50S型，上海博讯实业有限公司；

离心机：80－2型，江苏金坛市环宇科学仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 纳豆芽孢杆菌及指示菌的分离、纯化及保藏 纳豆芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等指示菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，微球菌、根霉、米曲霉、毛霉采用马铃薯葡萄糖培养基，在适当的条件下培养，并纯化保存。

1.4.2 梯度稀释法确定纳豆芽孢杆菌的菌液浓度 采用梯度稀释法统计发酵28h后，液体培养基中的纳豆芽孢杆菌菌液浓度。

1.4.3 纳豆芽孢杆菌次生代谢产物抑菌效果的确定 取已知浓度的纳豆芽孢杆菌菌液，采用牛津杯法衡量纳豆芽孢杆菌代谢产物抑菌效果，以菌液稀释倍数、发酵温度、发酵时间为因素，进行单因素试验，以其对各指示菌作用产生抑菌圈直径的大小为指标，建立因素水平表，选取两种具有代表性的指示菌，确定纳豆芽孢杆菌次生代谢产物最佳抑菌条件。

（1）菌液稀释倍数的影响：改变菌液的稀释倍数，作用于指示菌，37℃培养28h后测量抑菌圈直径，探究菌液浓度对纳豆芽孢杆菌代谢产物抑菌效果的影响。

（2）发酵温度的影响：在不同温度梯度（34，35，36，37，38，39，40℃）下培养28h。培养结束后，梯度稀释后作用于指示菌，测量抑菌圈直径，探究发酵温度对纳豆芽孢杆菌代谢产物抑菌效果的影响。

（3）发酵时间的影响：在37℃下分别培养18，20，22，24，26，28，30，32h，梯度稀释后作用于指示菌，测量抑菌圈直径，探究发酵时间对纳豆芽孢杆菌代谢产物抑菌效果的影响。

1.4.4 高温对纳豆芽孢杆菌发酵液次生代谢产物抑菌功能的影响 将培养好的纳豆芽孢杆菌原菌液和经梯度稀释（10，102，103，104倍）的稀释液，在80 ℃下处理20min后，于37℃培养28h，作用于指示菌，记录各抑菌圈直径，并与未高温培养时的抑菌效果做比较。

1.4.5 纳豆芽孢杆菌次生代谢产物与Nisin和Natamycin抑菌效果的对比研究 根据以上试验结果，选用较适宜条件下培养的纳豆芽孢杆菌发酵液，在相同条件下与1%Nisin和1%Natamycin试剂共同作用于各指示菌，并记录各抑菌圈直径，分析其抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌发酵液的菌液浓度

采用梯度稀释法计量菌液浓度，进行3次平行试验，确定纳豆芽孢杆菌菌液中含菌浓度为7.0×106个／mL。

2.2 发酵液稀释倍数对其次生代谢产物抑菌效果的影响

由表1可知，纳豆芽孢杆菌发酵液稀释10倍时，各指示菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最好。发酵液稀释1～100倍时，纳豆芽孢杆菌次生代谢产物作用于各指示菌有较明显抑菌圈，且抑菌圈的直径变化较大，选取此范围作为抑菌效果响应曲面试验中发酵液浓度范围。原液抑菌效果比稀释10倍效果略差，可能因原液的浓度大，黏度大，抑菌物质不易扩散导致抑菌效果不佳。

表1 纳豆芽孢杆菌发酵液浓度对抑菌效果的影响†Table 1 The effect of the bacteriostatic efficacy with the tunning of Bacillus natto by different concentration

2.3 发酵温度对其次生代谢产物抑菌效果的影响

由表2可知，在37℃下发酵的纳豆芽孢杆菌发酵液，对各指示菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最好。发酵温度在34～40℃时，纳豆芽孢杆菌处于代谢旺盛期，代谢产物产量较高，且其中抑菌物质含量较高，纳豆芽孢杆菌次生代谢产物作用于各指示菌有较明显抑菌圈，且抑菌圈直径变化较大，本试验选取这个范围作为纳豆芽孢杆菌次生代谢产物抑菌效果响应曲面试验中菌液发酵温度的使用范围。

2.4 发酵液发酵时间对其次生代谢产物抑菌效果的影响

由表3可知，发酵28h时的纳豆芽孢杆菌发酵液，对各指示菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最好。发酵时间在24～32h时，纳豆芽孢杆菌发育处于对数增长期和持续期，其分泌代谢产物产量能够维持在一定水平，具有较好的抑菌效果，纳豆芽孢杆菌次生代谢产物作用于各指示菌有较明显抑菌圈，且抑菌圈的直径变化较大，本试验则选取这个范围作为纳豆芽孢杆菌次生代谢产物抑菌效果响应曲面试验中菌液发酵时间的使用范围。

2.5 对金黄色葡萄球菌抑菌效果的响应曲面试验

通过对3组单因素试验结果的分析，确定出纳豆芽孢杆菌次生代谢产物抑菌效果BBD正交试验的因素水平见表4，试验结果见表5。

式（1）为采用因素代码形式的金黄色葡萄球菌抑菌圈直径与各操作因素之间关系的二次方程模型：Y1＝13.20＋0.78A ＋0.15B －0.050C＋0.32AB ＋0.13AC＋0.38BC－2.06A2－2.5B2－1.71C2（1）

由响应曲面试验可知，在3个因素交互作用（图1～3）下，对抑菌效果的影响顺序是：（发酵温度×发酵时间）＞（菌液稀释倍数×发酵时间）＞（菌液稀释倍数×发酵温度）。从单个因素影响来看，菌液稀释倍数对次生代谢产物的抑菌效果影响最大，且在所选的试验水平范围内存在最优响应因子水平。由回归方程确定针对金黄色葡萄球菌的纳豆芽孢杆菌次生代谢产物的最佳抑菌条件：菌液稀释59.94倍、发酵温度37.12℃、发酵时间27.99h。选取抑菌条件将菌液稀释60倍，发酵温度37℃，发酵时间28h，纳豆芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，抑菌圈直径为13.7mm，确为最大值，对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好。

表2 发酵温度对纳豆芽孢杆菌发酵液抑菌效果的影响†Table 2 The effect of the bacteriostatic efficacy with the tunning of Bacillus natto by different fermentation temperature

表3 发酵时间对纳豆芽孢杆菌发酵液抑菌效果的影响†Table 3 The effect of the bacteriostatic efficacy with the tunning of Bacillus natto by different fermentation time

表4 BBD正交试验因素水平表Table 4 The BBD orthogonal factors level table

表5 BBD正交试验方案及试验结果Table 5 The BBD orthogonal test program and test results

2.6 对根霉菌抑菌效果的响应曲面试验

根据所列正交试验因素水平表得到纳豆芽孢杆菌次生代谢产物对根霉菌抑菌效果BBD正交试验结果见表5。

式（2）为采用因素代码形式的根霉菌抑菌圈直径与各操作因素之间关系的二次方程模型：

由响应曲面试验可知，在3个因素交互作用（图4～6）下，对抑菌效果的影响顺序是：（发酵温度×发酵时间）＞（菌液稀释倍数×发酵时间）＞（菌液稀释倍数×发酵温度）。从单个因素影响来看，菌液稀释倍数对其次生代谢产物的抑菌效果影响最大，且在所选的试验水平范围内存在最优响应因子水平。由回归方程确定针对根霉菌的纳豆芽孢杆菌次生代谢产物的最佳抑菌条件：菌液稀释56.31倍、发酵温度37.02℃、发酵时间27.67h。将菌液稀释56倍、发酵温度为37℃，发酵时间为27.6h时，纳豆芽孢杆菌次生代谢产物对根霉菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径为12.1mm。

2.7 高温处理后的纳豆芽孢杆菌对其次生代谢产物抑菌功能的影响

高温处理后纳豆芽孢杆菌次生代谢产物抑菌效果见表6。高温处理纳豆芽孢杆菌发酵液，可使纳豆芽孢杆菌处于芽孢状态，使得部分酶类变性失活，可验证纳豆芽孢杆菌次生代谢产物中化学物质起抑菌作用。经高温后的纳豆芽孢杆菌，其次生代谢产物仍具有抑菌功能，但其抑菌效力有所降低。

图1 菌液稀释倍数－发酵温度交互作用的响应面和等高线图Figure 1 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation temperature

图2 菌液稀释倍数－发酵时间交互作用的响应面和等高线图Figure 2 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation time

图3 发酵温度－发酵时间交互作用的响应面和等高线图Figure 3 The response surface and contour of the interaction with fermentation temperaturefermentation time

表6 高温处理后纳豆芽孢杆菌次生代谢产物抑菌效果†Table 6 The bacteriostatic efficacy of the Bacillus nattotunning by high temperature

2.8 纳豆芽孢杆菌次生代谢产物与Nisin和Natamycin试剂抑菌效果的对比

由上述试验结果可知，稀释10倍的纳豆芽孢杆菌在37℃下发酵28h后，其次生代谢产物具有较好抑菌效果。用此条件下的纳豆芽孢杆菌发酵液与Nisin及Natamycin对比抑菌效果，结果见表7。

由表7可知，纳豆芽孢杆菌次生代谢产物与Nisin、Natamycin均具有广谱抗菌作用，对多种微生物都有抑菌效果，对革兰氏阳性菌的抑菌效果尤其显著。纳豆芽孢杆菌发酵液较前二者抑菌效果略差，但从安全性，以及生产成本看，更有开发价值。如果进一步研究，有可能使纳豆芽孢杆菌发酵液的抑菌效果达到甚至超过前二者。

图4 菌液稀释倍数－发酵温度交互作用的响应面和等高线图Figure 4 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation temperature

图5 菌液稀释倍数－发酵时间交互作用的响应面和等高线图Figure 5 The response surface and contour of the interaction with liquid multiplefermentation time

图6 发酵温度－发酵时间交互作用的响应面和等高线图Figure 6 The response surface and contour of the interaction with fermentation temperature and fermentation time

3 结论

通过以上研究可知，纳豆芽孢杆菌次生代谢产物对金黄色葡萄球菌及根霉等微生物都具有很好的抑菌效果，最优条件：金黄色葡萄球菌，纳豆芽孢杆菌发酵液浓度稀释59.94倍，发酵温度37.12℃，发酵时间27.99h；根霉菌，纳豆芽孢杆菌发酵液浓度稀释56.31倍，发酵温度37.02℃，发酵时间27.67h。试验结果也表明，在37℃下发酵28h，经80℃处理20min的纳豆芽孢杆菌次生代谢产物仍具有抑菌功能，但抑菌效力有所降低。纳豆芽孢杆菌次生代谢产物与Nisin、Natamycin类似，均具有广谱抗菌作用，且对革兰氏阳性菌的抑菌效果尤其显著。

表7 纳豆芽孢杆菌代谢产物与Nisin及纳他霉素的抑菌效果对比†Table 7 The bacteriostatic efficacy contrast of the tunning of Bacillus natto ，Nisin and Natamycin

今后的研究将对纳豆芽孢杆菌代谢产物成分分析及使用安全性进行进一步分析。

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