烟叶中多糖的分离及单糖组成

舒俊生 田振峰 陈开波 毛 健

（1.安徽中烟工业有限公司技术中心，安徽 合肥 230088；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

多糖是由多个相同或不同的单糖基以糖苷键相连而形成的高聚物，在自然界分布极广［1－4］。多糖在烟草物理保润性能方面具有重要的作用［5－7］，对烟草的感官品质和产品质量稳定性也具有较强影响［8，9］。但是，目前有关烟叶多糖提取分离的研究却较少，朱小平等［10］对烟草水溶性多糖进行过分离纯化分析研究，认为烟叶多糖是以半乳糖醛酸为主，兼含阿拉伯糖、木糖等杂多糖，而未对多糖的单糖组成及比例做进一步试验证明。离子色谱法是目前研究糖类化合物中单糖组成及比例不可缺少的手段，且具有较高的灵敏度和精密度。因此，本研究拟对烟叶中的多糖进行提取、分离，并采用离子色谱法对其组成的单糖进行分析，以期为烟草的保润性能评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品

烟叶：品种 K326，等级 B2F（上部烟叶）、C3F（中部烟叶）、X2F（下部烟叶），采自云南陆良地区。

1.2 主要试剂

无水乙醇、正丁醇、氯仿、乙醚、丙酮、氯化钙、苯酚、1－萘酚、碳酸钡、浓硫酸：分析纯，上海国药集团；

阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖：色谱纯，美国Fluka公司。

1.3 主要仪器

离子色谱仪：DIONEX ICS3000型，美国戴安公司；

离心机：SIGMA2－16K型，德国Sigma公司；

超声波发生器：SONIFIER 450型，美国Branson公司；

冷冻干燥机：ALPHA型，德国Sigma公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理 烤烟样品（不同样品来源的上、中、下部烟叶）在40℃烘2h，粉碎后过40目筛。称取10g烟末，用100mL 80% 乙醇、30℃超声辅助提取3次，每次0.5h。离心分离除去上层清液，残渣风干后用于多糖提取。

1.4.2 多糖提取工艺

（1）提取：将预处理后的烟末残渣，加100mL蒸馏水，30℃超声辅助提取，每次0.5h，重复3次。每次提取后，5 000r／min离心5min，得上清液，合并3次上清液。

（2）脱色：由于烟叶多糖提取液颜色呈深褐色，故对提取液进行脱色。向混合后的提取液中加入10g活性炭，50℃下搅拌0.5h，5 000r／min离心5min，得澄清液。

（3）去果胶：向得到的澄清液中加入10%的CaCl2，静置过夜，离心（5 000r／min，5min）去除果胶。将澄清液于65℃真空浓缩至原体积的1／5，加入5倍浓缩液体积的无水乙醇溶液，－20℃冷冻静置过夜，离心得白色沉淀。

（4）脱蛋白：沉淀用蒸馏水溶解，Sevage法去蛋白，按多糖溶液∶氯仿∶正丁醇＝2∶0.2∶0.04的比例在分液漏斗里振荡，4 500r／min离心5min，反复多次。再加入4倍体积的无水乙醇溶液，－20℃冷冻静置过夜，离心得白色沉淀。

（5）干燥：沉淀加无水乙醇混匀，离心，重复操作3次；分别用丙酮、乙醚各洗涤3次，50℃真空干燥。最后得白色块状烟叶多糖。

1.4.3 烟草多糖含量 按式（1）计算：

1.4.4 多糖样品的分析

（1）碘－碘化钾反应：取1mL烟叶多糖样品制成的溶液，加入碘－碘化钾溶液中，观察颜色变化。

（2）考马斯兰显色反应：取1mL烟叶多糖溶液，加入0.5mL 0.1%的考马斯兰乙醇溶液，混匀，煮沸1～2min，冷却，观察颜色变化。

（3）Molish反应：取1mL烟叶多糖溶液，加入2滴Molish试剂，摇匀，沿试管壁慢慢加入1mL浓硫酸，观察浓硫酸和糖交界面颜色的变化。

1.4.5 离子色谱法分析多糖的单糖组成 各取少量干燥上、中、下部烟叶提取的多糖样品，加入1.0mol／L 的H2SO4溶液2mL，60℃水浴水解6h，冷却后，加入BaCO3中和，4 500r／min离心除去BaSO4沉淀，得上清液，稀释至100mL，用0.2μm的一次性滤头过滤，直接采用离子色谱进行多糖的单糖组成分析。单糖的定性分析采用与标准单糖色谱保留值相对照的方法，单糖含量采用定量标准曲线法求得。先配制一定浓度的阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖溶液，然后稀释，进样，得到单糖含量标准曲线，然后对水解后样品中单糖含量进行测定。

色谱条件：阴离子交换柱：CarboPac PA－1；柱温：30℃；流动相：25mmol／L；NaOH 流量：0.25mL／min；等梯度进样；进样量：10μL；检测器：ED50；工作电极：金电极；参比电极：Ag／AgCl参比电极。

1.4.6 红外光谱测定 采用Necolit 5D×B型红外光谱仪进行测定。KBr压片，扫描范围：4 000～400cm－1，扫描次数：32次，分辨率：4cm－1。

2 结果与讨论

2.1 烟叶多糖含量测定

分别称取B2F、C3F、X2F 10g，经过提取、脱蛋白去果胶后，测定多糖重量。上、中、下部烟叶粗多糖量分别为1.01，0.74，0.72g。上、中、下部烟叶粗多糖的提取率分别为10.13%，7.36%，7.18%。烟叶部位对多糖的影响规律与茶叶多糖的部位分布规律类似［11］。从上部到下部，烟叶多糖含量，呈下降趋势。

2.2 烟草多糖纯度鉴定

多糖样品水溶液中滴入碘－碘化钾溶液，颜色没有变化，说明溶液中不含淀粉；滴入考马斯兰溶液后，为亮蓝色，说明不含蛋白质；加入 Molish试剂后，在两层液面间形成紫色环，说明样品含有多糖。

2.3 离子色谱分析单糖组成

图1为标准单糖含量测定的离子色谱图；图2～4分别为上、中、下部烟草多糖水解后单糖含量测定的离子色谱图。试验结果表明，所取烟叶所含多糖主要组成单糖是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和果糖。这4种单糖的摩尔比组成：上部烟叶为38∶0.6∶4.5∶6.1；中部烟叶为22.7∶0.6∶3.2∶2.5；下部烟叶为17.4∶0.6∶2.5∶1.8。不同部位烟叶的多糖中，阿拉伯糖为主要成分，这与朱小平的研究结果不同［9］，可能与其没有脱除果胶有关。此外，烟草多糖中单糖组成与其它植物多糖和菌类多糖差异显著［12－14］。

2.4 烟叶多糖红外光谱分析

图1 标准单糖分离的离子色谱图Figure 1 Ion chromatogram of standard monosaccharide

图2 上部烟叶多糖水解后单糖分析的离子色谱图Figure 2 Ion chromatogram of monosaccharide from the upper leaf polysaccharide

图5是上部烟叶多糖样品在4 000～400cm－1区的红外吸收光谱。由图5可知，上部烟叶具有多糖类物质的一般特征伸缩振动峰。红外检测结果显示，上、中、下部烟叶粗多糖的红外光谱图完全一致。3 399cm－1附近的强吸收峰是糖分子中羟基的伸缩振动吸收峰；2 925cm－1附近的吸收峰是C－H的伸缩振动峰；在1 641cm－1左右的峰是多糖水合振动峰；1366，1243cm－1附近的吸收峰是C－H的变角振动峰；1 163，1 077，1 038cm－1处的强吸收峰为吡喃糖环羟基的变角振动吸收峰，说明烟叶多糖的单糖以吡喃糖苷的形式存在。1 730cm－1附近没有糖醛酸的特征吸收，这与离子色谱糖醛酸含量测定结果一致，表明烟叶多糖可能为一中性杂多糖。此外，由于844，891cm－1处未出峰，不能判断烟叶多糖的糖苷键连接类型。

图3 中部烟叶多糖水解后单糖分析的离子色谱图Figure 3 Ion chromatogram of monosaccharide from the middle leaf polysaccharide

图4 下部烟叶多糖水解后单糖分析的离子色谱Figure 4 Ion chromatogram of monosaccharide from the lower leaf polysaccharide

图5 上部烟叶多糖的红外吸收光谱Figure 5 Infrared chromatogram of the upper leaf polysaccharide

3 结论

本研究对烟草中的多糖进行了提取，经活性炭脱色、氯化钙去果胶、Sevage法除蛋白质、脱脂处理后，冷冻干燥得到粗多糖。然后利用离子色谱对多糖的水解产物中单糖的种类和比例进行了分析，结果表明，烟叶部位对多糖含量有显著影响，上部烟叶多糖含量明显高于中部和下部烟叶。烟叶多糖主要单糖组成是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和果糖，这些单糖以吡喃糖苷的形式存在。

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