桑椹酒香气成分的HS－SPME－GC－MS分析

卫春会 边名鸿 黄治国

罗惠波1，2 王 毅1 杨晓东1

（1.四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000）

桑椹酒是一种新兴的果酒，是以新鲜桑椹、干桑椹或桑椹汁为原料，利用酵母经过酒精发酵、陈酿等过程酿制而成，具有典型的桑椹香味和酒香，口味爽口。经发酵的桑椹酒营养丰富，而且具有许多保健功能。饮用后，不但可以改善女性手脚冰冷的毛病，更有补血、强身、益肝、补肾、明目等功效，可称之为水果酒中的极品［1，2］。

顶空固相微萃取是一种全新概念的样品预处理浓缩技术，它克服了传统提取方法的缺陷，具有简便、灵敏度高、重现性及线性好、样品处理时间短、分析样品用量少、无需有机溶剂和绿色环保等优点［3－5］。顶空固相微萃取－气质联用法（HS－SPME－GC－MS）已广泛应用于樱桃酒、葡萄酒、苹果酒、黄酒等酒类的挥发成分的研究［6－9］，但对桑椹发酵型果酒香气成分顶空固相微萃取的方法进行优化尚未见报道。本试验对顶空固相微萃取法提取桑椹果酒中香气成分的条件进行了优化，使用气质联用仪进行分析，为进一步完善桑椹酒的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

桑椹酒：酿酒生物技术及应用四川省重点实验室提供。

1.2 主要仪器与设备

气相色谱－质谱联用仪：6890N－5975B型，美国Agilent科技有限公司；

顶空固相微萃取、SPME手动进样柄和萃取头50／30μmDVB／CAR／PDMS：上海安谱科学仪器有限公司；

恒温磁力搅拌器：HJ－8B型，金潭市正基仪器有限公司。

1.3 试验方法

参照文献［10］，于15mL样品瓶中加入桑椹酒、NaCl和磁力转子，盖好瓶盖后，迅速置于磁力搅拌加热台上，转速为200r／min条件下，加热搅拌。然后将已经热解析过的萃取头插入样品瓶的顶空部分，萃取头距离液面1cm处，然后将已吸附香味物质的萃取头插入气相色谱进样口，230℃条件下解析3min。每个样品重复3次。

1.3.1 萃取条件的优化

（1）NaCl浓度的优化：取5mL桑椹酒样品于样品瓶内，加入不同质量的 NaCl（0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30g／mL），萃取温度40 ℃，萃取和平衡时间均为30min。萃取完成后用于GC－MS分析。

（2）萃取温度的优化：取5mL桑椹酒样品于样品瓶内，按照0.2g／mL量加入NaCl，萃取和平衡时间均为30min，萃取温度分别为20，25，30，35，40，45，50℃。萃取完成后用于GC－MS分析。

（3）萃取时间的优化：取5mL桑椹酒样品于样品瓶内，按照0.2g／mL量加入 NaCl，萃取温度40℃，平衡时间30min，萃取时间分别为5，10，20，30，40，50，60min。萃取完成后用于GC－MS分析。

（4）平衡时间的优化：取5mL桑椹酒样品于样品瓶内，按照0.2g／mL量加入 NaCl，萃取温度40℃，萃取时间30min，平衡时间分别为5，10，20，30，40，50，60min。萃取完成后用于GC－MS分析。

1.3.2 气相色谱－质谱条件

（1）色谱条件：DB－WAX 60.0m×0.25mm×0.25μm毛细管色谱柱；进样口温度230℃；分流比30∶1；程序升温：60℃保持3min，以5℃／min升到200℃，再以10℃／min升到230℃保持1min；载气：99.999%氦气，载气流速：1mL／min。

（2）质谱条件：电离电压70eV，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电离方式为EI，质量扫描范围为20～500amu，溶剂延迟3min。

1.3.3 判断标准 试验采用气相色谱－质谱联用仪对桑椹酒进行分析，以出峰个数、峰面积以及香味物质的数目3个评价指标进行综合分析，同时与NIST谱库对比，对物质进行定性。

2 结果与分析

2.1 单因素条件优化结果与分析

2.1.1 NaCl浓度 本试验研究了NaCl浓度对SPME萃取量的影响，对NaCl浓度进行了优化。结果见图1。

由图1可知，不同NaCl浓度萃取得到的香味物质的种类分别为44，43，47，55，56，42，39。在低浓度的 NaCl条件下，盐析可以提高萃取香味物质的种类，随着NaCl浓度的增加，萃取效率逐渐降低。相比较而言，NaCl浓度对醇类物质的影响比酯类和酸类要明显大一些。而盐析可提高某几种物质的信号强度，但对其它化合物的检测灵敏度降低。同时，盐析作用对于极性组分的影响要远大于非极性组分，所以不同组分对于添加盐的用量存在差异。根据试验结果确定在NaCl浓度为0.2g／mL时，桑椹酒萃取效果最好。

图1 NaCl浓度对萃取量的影响Figure 1 Effect of sodium chloride concentration on extractable amount

2.1.2 萃取温度 试验研究了萃取温度对SPME萃取量的影响，对萃取温度进行了优化。结果见图2。

图2 萃取温度对萃取量的影响Figure 12 Effect of extraction temperature on extractable amount

由图2可知，随着萃取温度的增加，出峰的个数、总峰面积和香味物质种类都随着萃取温度的增加而增加；但在40℃后，出峰个数、总峰面积以及香味物质种类都随着温度的变化有较明显的减少。由于在温度升高时较多的分析物会从基质中逸出进入液面的上方，增加了总峰面积、出峰个数及香味物质的萃取效率，但超过一定温度萃取量开始降低。下降的原因有可能是因为竞争性的结果，乙醇吸附量会大量的积累，从而降低了其它香味成分的吸附。因此，最终选择40℃为最佳萃取温度。

2.1.3 萃取时间 本试验研究了萃取时间对SPME萃取量的影响，对萃取时间进行了优化。结果见图3。

图3 萃取时间对萃取量的影响Figure 3 Effect of time on extractable amount

萃取所需要的时间，由待测组分的分配系数、物质扩散速率、样品基质、样品体积等因素决定。由图3可知，萃取过程均在刚开始时吸附量增加迅速，出现一转折点后上升缓慢，有的甚至出现下降。通过色谱分析可知，30min之前，随着萃取时间的增加，总峰面积和出峰个数都在增加，在30min出现转折点，总峰面积和出峰个数都随着萃取时间的延长而降低，较明显变化的香味物质是酯类、醇类和酸类。由此可见，在萃取时间为30min时，萃取量达到的效果最佳，故选择30min为最佳萃取时间。

2.1.4 平衡时间 由图4可知，随着平衡时间的增加，出峰个数和香味物质的种类都有明显的增加，而总峰面积先是变化不明显，然后明显增加；在30min后，随着平衡时间的继续增加，总峰面积、出峰个数以及香味物质的种类都有明显的降低。据分析可知，在萃取的过程中，形成气－液两相，在平衡的过程中，随着时间的增加，分配系数发生改变，萃取头吸取到的物质状态发生变化，从而影响萃取量。故选择30min为最佳平衡时间。

2.2 桑椹酒香味物质的定性

由单因素试验结果可知：最佳萃取条件为NaCl浓度0.2g／mL，萃取温度40 ℃，平衡时间30min，萃取时间30min。根据最佳萃取条件，利用HS－SPME与GC－MS联用法对桑椹酒香味物质进行定性分析。结果见图5和表1。

图4 平衡时间对萃取量的影响Figure 4 Effect of equilibrium time on extractable amount

图5 桑椹酒香味物质成分的总离子流图Figure 5 GC－MS total ion chromatogram of aroma compounds in mulberry wine

由图5和表1可知，桑椹酒通过固相微萃取能够较好的分离其中的香味成分。试验共分离出54种香味成分，其中酯类19种、醇类17种、酸类4种、其它14种。其中酯类、醇类、酸类分别占香味成分总数的49.68%，19.65%，6.52%。桑椹酒的主体香味含量排前12种的依次为棕榈酸乙酯、乙缩醛、苯乙醇、乙酸异戊酯、丁内酯、辛酸乙酯、乙酸、异丁醇、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丙醇。这12种物质基本构成了桑椹酒的主体香味成分。梁贵秋等［11］对桑椹果酒挥发性成分的GC／MS分析结果与本研究的结果有所不同，可能是因为桑椹品种、酿造所用菌株、酿造工艺以及萃取条件不同造成的。陈娟等［12］采用溶剂萃取结合GC－MS的方法对不同品种桑椹的香气成分进行分析，得知桑椹原料中主要包括高级脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、芳香醇、脂肪醛以及脂肪酮等香气成分，为本试验桑椹酒的研究提供了基础数据依据。

表1 HS－SPME－GC－MS法分析桑椹酒中香味成分的结果Table 1 HS－SPME－GC－MS analytical results of aromatic compounds in mulberry wine

3 结论

本试验采用顶空固相微萃取和气相色谱质谱联用的方法检测分析了桑椹酒中的香味成分，对固相微萃取桑椹酒中香味成分的条件进行了优化，得到最佳萃取条件为NaCl浓度0.2g／mL，萃取温度40℃，萃取时间30min，平衡时间30min。在最佳萃取条件下，通过气质联用法共分析出54种香味成分，其中包括酯类19种、醇类17种、酸类4种、其它14种；其中含量最多的是酯类和醇类，分别占总的香味成分的49.68%和19.65%，其中含量排前十二的依次为棕榈酸乙酯、乙缩醛、苯乙醇、乙酸异戊酯、丁内酯、辛酸乙酯、乙酸、异丁醇、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丙醇。这12种物质为桑椹酒的主要香味成分，构成桑椹酒的特有品质。

本研究从NaCl浓度、萃取温度和时间三方面对桑椹酒香味物质的萃取条件进行了优化，也对桑椹酒中的香味物质做了定性分析，但影响萃取的因素是多方面的，也是综合性的，同时，香味物质的提取和分析方法也是多样的，因此，后期有待深入研究，对进一步解析桑椹酒的香味成分具有十分积极的意义。

1 梁贵秋，吴婧婧，祁广军，等.桑椹酒的营养价值及保健作用［J］.现代食品科技，2011，27（4）：457～460.

2 梁贵秋，吴婧婧，陆春霞，等.浅谈桑椹酒的酿制工艺与营养成分［J］.中国蚕业，2011（4）：70～73.

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4 游义琳，王秀芹，战吉宬，等.HS－SPME－GC／MS方法在白兰地香气成分分析中的应用研究［J］.中外葡萄与葡萄酒，2008（6）：8～13.

5 康旭，孟鸳，乔宇，等.固相微萃取－气相色谱－质谱联用测定甜面酱挥发性成分条件的优化［J］.中国调味品，2010，35（12）：99～103，106.

6 张妮，肖作兵，于海燕，等.顶空固相微萃取－气质联用测定樱桃酒中挥发性成分［J］.食品科学，2011，32（10）：97～102.

7 汪立平，徐岩，赵光螯，等.顶空固相微萃取法快速测定苹果酒中的香味物质［J］.无锡轻工业大学学报，2003，22（1）：1～6.

8 程劲松.顶空固相微萃取－气相色谱法测定葡萄酒中的风味组分［J］.中外葡萄与葡萄酒，2003（2）：19～21.

9 罗涛，范文来，郭翔，等.顶空固相微萃取（HS－SPME）和气相色谱－质谱（GC－MS）联用分析黄酒中挥发性和半挥发性微量成分［J］.酿酒科技，2007（6）：121～124.

10 张明霞，赵旭娜，杨天佑，等.顶空固相微萃取分析白酒香气物质的条件优化［J］.食品科学，2011，32（12）：49～53.

11 梁贵秋，陆春霞，李全，等.桑椹果酒挥发性成分的GC／MS分析［J］.现代食品科技，2012（12）：1 800～1 802.

12 陈娟，阚建全，杨蓉生.不同品种桑椹香气成分的GC－MS分析［J］.食品科学，2010，32（18）：239～243.