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实时荧光PCR法快速检测耐热霉菌费氏新萨托菌

2013-09-07郑晓冬陈小珍

食品与机械 2013年3期
关键词:费氏霉菌用量

张 慧 郑晓冬 姜 侃 汪 新 陈小珍

(1.浙江省质量检测科学研究院理化分析检测部,浙江 杭州 310013;2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州 310058)

费氏新萨托菌(Neosartoryafischer)是一种耐热、耐干燥、耐酸碱的菌种,广泛分布于土壤尤其是果园的土壤中,是果蔬汁中易污染的耐热霉菌之一。它不仅是饮料和热加工食品中的有害菌,易引起食品贮存期间的腐败变质[1-4],也是人畜共患的致病菌,可引起角膜炎、心内膜炎和肺部曲霉病等,还可产生真菌毒素,严重威胁人们的身体健康[5-8]。目前耐热霉菌的检测通常采用PDA平板培养方法,检测时间长[2],因此,快速、准确的分子生物学检测技术逐渐用于耐热霉菌的检测[9]。有研究[10,11]采用普通 PCR 技术,利用包含在核糖体单位的内部转录间隔区上的序列作为特异性引物,实现费氏新萨托菌的快速鉴别,但采用实时荧光PCR技术快速检测费氏新萨托菌的研究较少。

Beta-tubulin基因序列是耐热霉菌——费氏新萨托菌的保守序列,本试验在此基础上设计特异性引物和探针,优化反应体系的组成,建立实时荧光PCR快速检测方法,对果蔬汁产品质量有效控制和保障食品安全,具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株及来源

费氏 新 萨托 菌 (Neosartoryafescheri)ATCC66640、ATCC66641,雪 白 丝 衣 霉 菌 (Byssochlamys nivea)ATCC22260、ATCC18742,纯 黄 丝 衣 霉 (Byssochlamys fulva)ATCC24474、ATCC24008:北京中原合聚经贸有限公司;

宛 氏 拟 青 霉 (Paecilomyces variotii)CICC4024、CICC4025:中国工业微生物菌种保藏管理中心;

宋内志贺菌 (Shigella sonnei)ATCC25931、金黄色葡萄球菌 (Staphylococous aureus)ATCC6538、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC51329、福 氏 志 贺 氏 菌(Shigella flexneri)ATCC12022、 溶 血 性 链 球 菌(Streptococcus hemolyticus)CMCC32210、大 肠 埃 希 氏 菌(Escherichia coli)ATCC25922:上 海 汉 尼 生 物 技 术 有 限公司。

1.1.2 主要仪器

高速离心机:Microfuge 16型,贝克曼库尔特商贸有限公司;

电子天平:AL204型,梅特勒-托利多(仪器)上海有限公司;

实时荧光PCR仪:7300型,美国应用生物系统公司。

1.1.3 主要试剂

Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒:杭州博日科技有限公司;

PCR反应缓冲液(10×)(Mg2+free)、MgCl2、dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷)混合物、DNA聚合酶:宝生物工程(大连)有限公司;

ROX染料:上海位点生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养 费氏新萨托菌在马铃薯葡萄糖培养基中培养3~6d(25℃),观察有菌丝体或菌丝球形成,挑出,以备提取DNA使用。

1.2.2 模板DNA提取 将1.2.1中制备的菌丝体参照Biospin真菌基因组DNA抽提试剂盒说明进行操作处理,提取真菌DNA模板。

1.2.3 引物设计 费氏新萨托菌引物设计参考KACC41668beta-tubulin的部分基因序列。利用PrimerExpressTM(V3.0,美国ABI公司)软件分析和设计引物和Taq-Man探针位点,序列见表1。引物和探针由Invitrogen公司合成。

表1 引物与Taqman探针序列Table 1 Specific primer and Taqman probe sequences

1.2.4 实时荧光PCR反应体系的优化

(1)实 时 荧 光 PCR 反 应 条 件:95 ℃ (3min),95 ℃(15s)、59℃(40s)、40个循环。

(2)实时荧光PCR反应体系按表2初始体系组成开始优化,依次优化ROX染料、Mg2+、DNA聚合酶、dNTP混合物的用量。

表2 实时荧光PCR反应体系组成Table 2 Real-time PCR reaction system

1.2.5 特异性试验 分别应用1.1.1中显示的费氏新萨托菌、雪白丝衣霉菌、纯黄丝衣霉菌、宛氏拟青霉菌和多株非耐热霉菌,提取DNA后,按试验优化的方法进行实时荧光PCR反应,验证费氏新萨托菌检测的特异性。

1.2.6 灵敏度试验 以费氏新萨托菌标准菌株ATCC66640为参考菌株,提取 DNA,提取液(57ng/μL)进行10倍梯度稀释,使 DNA 浓度约为101,100,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7ng/μL,应用以上 DNA 按优化的实时荧光PCR方法检测,观察结果,考察灵敏度。

2 结果与分析

2.1 PCR体系中探针的适用性和ROX染料用量选择

采用7300型PCR仪进行实时荧光PCR试验时,通常在反应体系中添加ROX荧光染料,用以校正加样误差或者是孔与孔之间的误差等,提供一个稳定的基线。

图1显示出不同ROX用量对费氏新萨托菌的PCR扩增结果的影响不同。0.8~2.0μL ROX的PCR体系均呈对数曲线扩增,0.8μL用量的曲线1不够平滑,综合考虑,选取1.2μL ROX用量作为以后试验中费氏新萨托菌实时荧光PCR扩增用量。

2.2 PCR体系中 Mg2+浓度的选择

Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素,Mg2+浓度过高,会增加非特异性扩增;Mg2+浓度过低,影响Taq酶发挥最佳活性。因此,PCR反应体系中Mg2+浓度的选择至关重要。

图2显示了Mg2+浓度对费氏新萨托菌实时荧光PCR的影响,当 Mg2+的用量为0.5,1.0μL时,均未出现对数扩增的曲线,说明PCR体系中Mg2+浓度过低,影响了PCR扩增的正常进行。由图2可知,费氏新萨托菌适宜的Mg2+用量在1.5~3.5μL。综合考虑,2.5μL Mg2+用量作为费氏新萨托菌以后PCR试验的用量。

图1 不同ROX用量对实时荧光PCR扩增影响Figure 1 Effect of ROX concentration on real-time PCR amplification

图2 Mg2+浓度对实时荧光PCR扩增影响Figure 2 Effect of Mg2+ concentration on real-time PCR amplification

2.3 PCR体系中DNA聚合酶用量的选择

DNA聚合酶是以DNA为复制模板,将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶是DNA片段扩增的关键物质。图3显示了不同的DNA聚合酶用量对费氏新萨托菌实时荧光PCR的影响,当酶的用量在0.2~0.6μL时,获得了良好的对数扩增曲线,并且不同酶用量的荧光强度差别不大。因此,认为PCR反应体系中0.2μL的用量即可满足实时荧光PCR扩增需求。

2.4 PCR体系中dNTP用量的选择

dNTP又叫三磷酸脱氧核糖核苷,dNTP混合液是三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1∶1∶1∶1的混合物,是构成DNA链的基本组成物质。

dNTP过少,影响PCR扩增效率;过量,dNTP可与Mg2+结合,从而降低体系中Mg2+浓度,造成Taq聚合酶活性下降。图4中费氏新萨托菌在dNTP用量为2.0,3.0,4.0μL时的PCR扩增效率较好,荧光信号的强度较高。为既满足试验需求又节约成本,以2.0μL为后续PCR试验用量。

图3 DNA聚合酶用量对实时荧光PCR扩增影响Figure 3 Effect of DNA polymerase concentration on real-time PCR amplification

图4 dNTP用量对实时荧光PCR扩增影响Figure 4 Effect of dNTP concentration on real-time PCR amplification

综上所述,经过优化后费氏新萨托菌的实时荧光PCR反应体系组成见表3。

2.5 特异性

实时荧光PCR检测费氏新萨托菌特异性的扩增结果见图5。图5显示该菌的引物和探针只对费氏新萨托菌(ATCC66640、ATCC66641)产生扩增,而对其他非费氏新萨托菌均无交叉反应,特异性良好。

2.6 灵敏度

对费氏新萨托菌的DNA提取物进行10倍梯度稀释后,进行实时荧光PCR反应,检测结果见图6。费氏新萨托菌最低8.6×10-4ng/反应体系的DNA能够被扩增;其他更低的稀释度没有信号增长。

3 讨论

费氏新萨托菌是人畜共患的致病菌,易污染果蔬汁而引起产品变质,胀罐胖听。本试验根据Genbank公布的betatubulin基因序列,设计了特异性引物和Taqman探针,建立了费氏新萨托菌的实时荧光PCR检测方法。与前人所建的费氏新萨托菌PCR检测方法[10,11]相比,该方法利用荧光探针通过实时荧光PCR实时监测目的基因的扩增,整个检测过程为完全闭管状态,避免了污染;同时,无需电泳等PCR后处理过程,快速、准确。实时荧光PCR反应体系中ROX染料、Mg2+浓度、DNA聚合酶和dNTP用量等,对PCR扩增反应的正常进行均有一定的影响,通过各梯度试验确定,25μL的反应体系中,1.2μL ROX 染料(10μΜ)、2.5μL MgCl2(25mM)、0.2μL DNA 聚合酶(5U/μL)、2.0μL dNTP混合物(2.5mM)、2.5μL 10×PCR反应缓冲液为适用于费氏新萨托菌扩增的最佳反应体系,基因组DNA的灵敏度为8.6×10-4ng/反应体系,方法特异性较好。该方法的建立为耐热霉菌费氏新萨托菌的快速检测提供了新思路。

表3 优化后的费氏新萨托菌实时荧光PCR反应体系Table 3 The optimal real-time PCR system

图5 费氏新萨托菌的特异性Figure 5 Specificity of real-time PCR for Neosartoryafescheri

图6 费氏新萨托菌实时荧光PCR检测灵敏度Figure 6 Sensitivity of real-time PCR for Neosartoryafescheri

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