实时荧光PCR法快速检测耐热霉菌费氏新萨托菌

张 慧 郑晓冬 姜 侃 汪 新 陈小珍

（1.浙江省质量检测科学研究院理化分析检测部，浙江 杭州 310013；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）

费氏新萨托菌（Neosartoryafischer）是一种耐热、耐干燥、耐酸碱的菌种，广泛分布于土壤尤其是果园的土壤中，是果蔬汁中易污染的耐热霉菌之一。它不仅是饮料和热加工食品中的有害菌，易引起食品贮存期间的腐败变质［1－4］，也是人畜共患的致病菌，可引起角膜炎、心内膜炎和肺部曲霉病等，还可产生真菌毒素，严重威胁人们的身体健康［5－8］。目前耐热霉菌的检测通常采用PDA平板培养方法，检测时间长［2］，因此，快速、准确的分子生物学检测技术逐渐用于耐热霉菌的检测［9］。有研究［10，11］采用普通 PCR 技术，利用包含在核糖体单位的内部转录间隔区上的序列作为特异性引物，实现费氏新萨托菌的快速鉴别，但采用实时荧光PCR技术快速检测费氏新萨托菌的研究较少。

Beta－tubulin基因序列是耐热霉菌——费氏新萨托菌的保守序列，本试验在此基础上设计特异性引物和探针，优化反应体系的组成，建立实时荧光PCR快速检测方法，对果蔬汁产品质量有效控制和保障食品安全，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株及来源

费氏 新 萨托 菌 （Neosartoryafescheri）ATCC66640、ATCC66641，雪 白 丝 衣 霉 菌 （Byssochlamys nivea）ATCC22260、ATCC18742，纯 黄 丝 衣 霉 （Byssochlamys fulva）ATCC24474、ATCC24008：北京中原合聚经贸有限公司；

宛 氏 拟 青 霉 （Paecilomyces variotii）CICC4024、CICC4025：中国工业微生物菌种保藏管理中心；

宋内志贺菌 （Shigella sonnei）ATCC25931、金黄色葡萄球菌 （Staphylococous aureus）ATCC6538、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）ATCC51329、福 氏 志 贺 氏 菌（Shigella flexneri）ATCC12022、 溶 血 性 链 球 菌（Streptococcus hemolyticus）CMCC32210、大 肠 埃 希 氏 菌（Escherichia coli）ATCC25922：上 海 汉 尼 生 物 技 术 有 限公司。

1.1.2 主要仪器

高速离心机：Microfuge 16型，贝克曼库尔特商贸有限公司；

电子天平：AL204型，梅特勒－托利多（仪器）上海有限公司；

实时荧光PCR仪：7300型，美国应用生物系统公司。

1.1.3 主要试剂

Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒：杭州博日科技有限公司；

PCR反应缓冲液（10×）（Mg2＋free）、MgCl2、dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷）混合物、DNA聚合酶：宝生物工程（大连）有限公司；

ROX染料：上海位点生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养 费氏新萨托菌在马铃薯葡萄糖培养基中培养3～6d（25℃），观察有菌丝体或菌丝球形成，挑出，以备提取DNA使用。

1.2.2 模板DNA提取 将1.2.1中制备的菌丝体参照Biospin真菌基因组DNA抽提试剂盒说明进行操作处理，提取真菌DNA模板。

1.2.3 引物设计 费氏新萨托菌引物设计参考KACC41668beta－tubulin的部分基因序列。利用PrimerExpressTM（V3.0，美国ABI公司）软件分析和设计引物和Taq－Man探针位点，序列见表1。引物和探针由Invitrogen公司合成。

表1 引物与Taqman探针序列Table 1 Specific primer and Taqman probe sequences

1.2.4 实时荧光PCR反应体系的优化

（1）实 时 荧 光 PCR 反 应 条 件：95 ℃ （3min），95 ℃（15s）、59℃（40s）、40个循环。

（2）实时荧光PCR反应体系按表2初始体系组成开始优化，依次优化ROX染料、Mg2＋、DNA聚合酶、dNTP混合物的用量。

表2 实时荧光PCR反应体系组成Table 2 Real－time PCR reaction system

1.2.5 特异性试验 分别应用1.1.1中显示的费氏新萨托菌、雪白丝衣霉菌、纯黄丝衣霉菌、宛氏拟青霉菌和多株非耐热霉菌，提取DNA后，按试验优化的方法进行实时荧光PCR反应，验证费氏新萨托菌检测的特异性。

1.2.6 灵敏度试验 以费氏新萨托菌标准菌株ATCC66640为参考菌株，提取 DNA，提取液（57ng／μL）进行10倍梯度稀释，使 DNA 浓度约为101，100，10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，10－7ng／μL，应用以上 DNA 按优化的实时荧光PCR方法检测，观察结果，考察灵敏度。

2 结果与分析

2.1 PCR体系中探针的适用性和ROX染料用量选择

采用7300型PCR仪进行实时荧光PCR试验时，通常在反应体系中添加ROX荧光染料，用以校正加样误差或者是孔与孔之间的误差等，提供一个稳定的基线。

图1显示出不同ROX用量对费氏新萨托菌的PCR扩增结果的影响不同。0.8～2.0μL ROX的PCR体系均呈对数曲线扩增，0.8μL用量的曲线1不够平滑，综合考虑，选取1.2μL ROX用量作为以后试验中费氏新萨托菌实时荧光PCR扩增用量。

2.2 PCR体系中 Mg2＋浓度的选择

Mg2＋是影响Taq酶活性的关键因素，Mg2＋浓度过高，会增加非特异性扩增；Mg2＋浓度过低，影响Taq酶发挥最佳活性。因此，PCR反应体系中Mg2＋浓度的选择至关重要。

图2显示了Mg2＋浓度对费氏新萨托菌实时荧光PCR的影响，当 Mg2＋的用量为0.5，1.0μL时，均未出现对数扩增的曲线，说明PCR体系中Mg2＋浓度过低，影响了PCR扩增的正常进行。由图2可知，费氏新萨托菌适宜的Mg2＋用量在1.5～3.5μL。综合考虑，2.5μL Mg2＋用量作为费氏新萨托菌以后PCR试验的用量。

图1 不同ROX用量对实时荧光PCR扩增影响Figure 1 Effect of ROX concentration on real－time PCR amplification

图2 Mg2＋浓度对实时荧光PCR扩增影响Figure 2 Effect of Mg2＋ concentration on real－time PCR amplification

2.3 PCR体系中DNA聚合酶用量的选择

DNA聚合酶是以DNA为复制模板，将DNA由5＇端点开始复制到3＇端的酶。DNA聚合酶是DNA片段扩增的关键物质。图3显示了不同的DNA聚合酶用量对费氏新萨托菌实时荧光PCR的影响，当酶的用量在0.2～0.6μL时，获得了良好的对数扩增曲线，并且不同酶用量的荧光强度差别不大。因此，认为PCR反应体系中0.2μL的用量即可满足实时荧光PCR扩增需求。

2.4 PCR体系中dNTP用量的选择

dNTP又叫三磷酸脱氧核糖核苷，dNTP混合液是三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1∶1∶1∶1的混合物，是构成DNA链的基本组成物质。

dNTP过少，影响PCR扩增效率；过量，dNTP可与Mg2＋结合，从而降低体系中Mg2＋浓度，造成Taq聚合酶活性下降。图4中费氏新萨托菌在dNTP用量为2.0，3.0，4.0μL时的PCR扩增效率较好，荧光信号的强度较高。为既满足试验需求又节约成本，以2.0μL为后续PCR试验用量。

图3 DNA聚合酶用量对实时荧光PCR扩增影响Figure 3 Effect of DNA polymerase concentration on real－time PCR amplification

图4 dNTP用量对实时荧光PCR扩增影响Figure 4 Effect of dNTP concentration on real－time PCR amplification

综上所述，经过优化后费氏新萨托菌的实时荧光PCR反应体系组成见表3。

2.5 特异性

实时荧光PCR检测费氏新萨托菌特异性的扩增结果见图5。图5显示该菌的引物和探针只对费氏新萨托菌（ATCC66640、ATCC66641）产生扩增，而对其他非费氏新萨托菌均无交叉反应，特异性良好。

2.6 灵敏度

对费氏新萨托菌的DNA提取物进行10倍梯度稀释后，进行实时荧光PCR反应，检测结果见图6。费氏新萨托菌最低8.6×10－4ng／反应体系的DNA能够被扩增；其他更低的稀释度没有信号增长。

3 讨论

费氏新萨托菌是人畜共患的致病菌，易污染果蔬汁而引起产品变质，胀罐胖听。本试验根据Genbank公布的betatubulin基因序列，设计了特异性引物和Taqman探针，建立了费氏新萨托菌的实时荧光PCR检测方法。与前人所建的费氏新萨托菌PCR检测方法［10，11］相比，该方法利用荧光探针通过实时荧光PCR实时监测目的基因的扩增，整个检测过程为完全闭管状态，避免了污染；同时，无需电泳等PCR后处理过程，快速、准确。实时荧光PCR反应体系中ROX染料、Mg2＋浓度、DNA聚合酶和dNTP用量等，对PCR扩增反应的正常进行均有一定的影响，通过各梯度试验确定，25μL的反应体系中，1.2μL ROX 染料（10μΜ）、2.5μL MgCl2（25mM）、0.2μL DNA 聚合酶（5U／μL）、2.0μL dNTP混合物（2.5mM）、2.5μL 10×PCR反应缓冲液为适用于费氏新萨托菌扩增的最佳反应体系，基因组DNA的灵敏度为8.6×10－4ng／反应体系，方法特异性较好。该方法的建立为耐热霉菌费氏新萨托菌的快速检测提供了新思路。

表3 优化后的费氏新萨托菌实时荧光PCR反应体系Table 3 The optimal real－time PCR system

图5 费氏新萨托菌的特异性Figure 5 Specificity of real－time PCR for Neosartoryafescheri

图6 费氏新萨托菌实时荧光PCR检测灵敏度Figure 6 Sensitivity of real－time PCR for Neosartoryafescheri

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