麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱对大鼠心肌细胞钙离子浓度和细胞膜钙通道的影响

侯平，杨丽，刘宁，陈磊

（1.辽宁中医药大学附属医院心内二科，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学基础医学院药理学教研室，沈阳 110847；3.中国医科大学药学院药理学教研室，沈阳 110001）

《伤寒论》第301条“少阴病，始得之，反发热，脉沉者，麻黄细辛附子汤主之”主张心动过缓症以麻黄细辛附子汤治疗。大量临床观察证明麻黄细辛附子汤对慢性心动过缓症状有改善作用［1～3］，但其配伍的现代医学作用机制尚不明确。抗心律失常药物的基本电生理作用是影响心肌细胞膜的离子通道，通过改变离子流而改变细胞的电生理特性。因此本研究通过考察麻黄细辛附子的3种活性单体麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱对大鼠心室肌细胞内钙离子浓度和高电压依赖性钙通道电流的影响，从中药有效单体对钙离子流影响的角度阐明麻黄细辛附子配伍的合理性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

健康大鼠由辽宁中医药大学动物实验中心提供［合格证号为SCXK（辽）2010-0001］，体质量250～300 g，雌雄不拘。所有实验动物操作均符合辽宁中医药大学动物保护条例。主要试剂有麻黄碱（南京泽朗医药科技公司，98.0%）、β-细辛醚（Sigma，批号03124JRV，70%）、去甲乌药碱（南京泽朗医药科技公司，98.0%）、胶原酶V（美国Sigma公司）。

1.2 仪器

激光扫描共聚焦显微镜（FV1000S-SIM/IX81，日本 OLYMPUS 公 司 ）、P-97 Flaming/Brown Micropipetter Puller（美国Sutter instrument公司）、MultiClamp700B（美国Axon公司）、pClamp10.0数据分析软件（美国Axon公司）、玻璃电极抛光器（MF-9，Narishige会社）、CF7D2型离心机（Hitachi Himac会社）等。

1.3 急性心室肌细胞的单离

正 常 台 氏 液 （mmol/L）：NaCl 143，KCl 5.4，NaH2PO40.30，HEPES 5，葡萄糖 5.5，MgCl20.5，CaCl21.8，以NaOH调pH 7.4。低钙台氏液：钙离子浓度为 20～70 μmol/L 的台式液。Kraftbrune（KB）液（mmol/L）：KOH 70，谷氨酸 50，KCl 40，KH2PO420，牛磺酸 20，MgCl23，葡萄糖 10，HEPES 10，EGTA 0.5，以HCl调pH 7.4。动物麻醉后迅速开胸取出心脏，置于4℃预冷0.9%氯化钠注射液中冲洗，剪开心包，经主动脉插管悬挂于改良的Langendorff灌流装置上，依次用正常台氏液、低钙台氏液经主动脉根部逆行灌流，当心脏跳动完全停止时，改用含胶原酶V（0.3 mg/mL）的台氏液消化20～30 min，再以KB液灌流，除去胶原酶后，将心室取下在KB中缓慢吹打分离，过滤离心后，将心室肌细胞置于KB液中稳定冷藏保存，4～8 h内使用。整个灌流系统温度保持在37℃，所有液体均用氧气饱和。

1.4 细胞内钙离子浓度变化的测定［4］

1.4.1 荧光探针标记：将急性单离心室肌细胞接种于经0.01%多聚赖氨酸包被的激光共聚焦测钙专用NEST细胞培养皿上静止30 min。待细胞完全贴壁后移去培养皿内液体，将198 μL正常台氏液和2 μLCa2+荧光探针染料Fluo-3/AM（终浓度为5μmol/L）混匀后加入培养皿小室中，37℃孵箱避光孵育45 min，使Fluo-3/AM与钙离子充分结合。测定前用正常台氏液清洗3次，加入200 μL含钙或无钙台氏液待测。将培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，在光镜下找到形态完整、横纹清晰的细胞，对其进行扫描（频率为0.2 Hz）。

1.4.2 钙离子浓度变化测定：Fluo-3/AM被动扩散进入细胞后，被酯酶水解释出Fluo-3，Fluo-3与Ca2+络合，在488 nm处的激光激发而产生荧光，其荧光值与钙离子浓度呈正相关，即以荧光值变化表示钙离子浓度变化，以平均荧光强度代表钙离子浓度。激发波长为488 nm，发射波长526 nm。先测定静息状态下给药前钙离子浓度作为对照，再加入相应浓度的试药麻黄碱、β-细辛醚或去甲乌药碱，观察细胞内钙离子浓度的动态变化情况，测定给药后钙离子浓度。

1.5 膜片钳全细胞记录技术

根据Hamill等［5］方法进行全细胞膜片钳记录实验。吸几滴细胞悬液加入细胞池中，置于倒置显微镜（IMT-2，Olympus）工作台上，放置 10 min 左右，待细胞贴壁后用台氏液持续灌流，流速为3 mL/min，温度保持在（25±2）℃，选择表面光洁、横纹清楚的细胞作为实验对象，将玻璃电极轻压在细胞表面，用负压使电极尖端与细胞膜表面形成GΩ高阻封接后，再以较大负压吸破细胞膜，补偿电容电流及电极串联电阻，形成全细胞记录。记录信号经Ag-AgCl电极引导，电流经放大器（MultiClamp 700B）放大，再经Digidata 1440进行A-D转换采集数据，由pClamp10.0软件处理和分析。用P-97电极拉制器将玻璃微电极拉制后，经抛光器抛光，充灌电极内液后尖端阻抗为5～10 MΩ。电极内液组成为（mmol/L）CsCl 130，HEPES 5，MgCl21，K2ATP 5，CPK 5，EGTA 1，CsOH调pH至7.2。细胞外灌流液为正常台氏液。

1.6 统计学处理

数据经Clamp10.0系统处理，经SPSS 15.0软件统计分析，计量资料以±s表示，两组间差异比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱对细胞内钙离子浓度的影响

经初步量效关系筛查，确定浓度为2 μmol/L的麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱对心肌细胞内钙离子浓度有显著影响且没有毒性作用，因此本研究中统一使用此浓度。Fluo-3/AM荧光探针法细胞内钙测定结果表明，2 μmol/L麻黄碱可使单离大鼠心肌细胞钙离子浓度显著升高至（122.99±6.93）%，与给药前（100%）比较，差异具有统计学意义（P<0.01）。而 2 μmol/L β-细辛醚和 2 μmol/L 去甲乌药碱则使钙离子浓度下降，分别为（83.38±1.30）%和（89.83±2.11）%，与给药前比较，差异有统计学意义（P<0.01）。

为了明确麻黄碱对钙离子浓度的升高作用是否与细胞外钙离子通过钙通道内流有关，采用细胞外液钙离子浓度为零溶液测定钙离子浓度。此时若麻黄碱给药后的钙离子浓度升高作用受到抑制，则表明该作用与细胞外钙离子内流有关。实验表明，在细胞外钙离子浓度为零的条件下，与给药前比较，2 μmol/L麻黄碱没有使钙离子浓度显著升高（103.33±2.19%），说明麻黄碱的升高钙离子浓度作用与促进细胞外钙离子通过钙离子通道内流有关。

2.2 麻黄碱、β细辛醚和去甲乌药碱对高电压依赖性钙离子通道电流的影响

为了确定高电压依赖性钙离子通道在3种单体对钙离子流动影响中的贡献，采用全细胞电压钳法测定心肌细胞高电压依赖性钙离子通道的钙电流（ICa）。设定保持电位-40 mV，指令电压为-50～+50 mV，步阶电压10 mV，刺激频率为2 Hz，刺激间隔为6 s，记录ICa。为消除细胞间误差，电流值以电流密度（pA/pF）表示。与给药前比较，2 μmol/L麻黄碱显著提高了心肌细胞ICa峰电流密度值（P<0.05），见图1、表 1；而 2 μmol/L β-细辛醚和 2 μmol/L 去甲乌药碱给药后分别与给药前比较略有下降，但差异没有统计学意义（表1）。

表1 2 μmol/L麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱给药前后ICa峰电流密度变化比较Tab.1 Changes of peak current density ICabefore and after administration of 2 μmol/L ephedrine，β-asarone and higenamine

3 讨论

中药麻黄的有效成分麻黄碱是一种肾上腺素能受体激动剂，既能促进去甲肾上腺素神经末梢释放去甲肾上腺素，又能直接作用于肾上腺素受体发挥拟肾上腺素作用。麻黄碱可激动β1受体使心肌收缩力增强，心输出量增加，心率加快。本研究初步筛查了麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱分别对心肌细胞钙离子流的影响，结果表明麻黄碱可使通过高电压依赖性钙通道电流密度增加，与钙离子浓度变化呈相同趋势，说明麻黄碱对钙离子流动的影响在于促进细胞膜电压依赖性的钙通道开放，钙离子大量流入细胞内，从而使钙离子浓度升高，可兴奋心肌细胞，但也可能造成心肌细胞过度兴奋而导致心律失常。

β-细辛醚使通过高电压依赖性钙通道的电流密度稍有减弱，使细胞内钙离子浓度显著下降，与其在皮质神经元细胞的作用基本相同［6］，表明β-细辛醚有一定的钙通道阻滞作用而使冠脉血管扩张［7］。研究证明去甲乌药碱能轻微上调β-肾上腺素受体［8］，提高窦房结自律性和改善房室传导，具有强心和提高心率作用［9］。因此，β-细辛醚与去甲乌药碱有改善心肌血供和增加心输出量的作用。同时，本研究发现β-细辛醚和去甲乌药碱均轻微降低钙内流，减轻细胞内钙超载，此结果进一步证实β-细辛醚和去甲乌药碱可对受损伤的心肌细胞有保护作用［10，11］。

综上所述，麻黄细辛附子三味中药的活性单体中，麻黄碱能升高细胞内钙离子浓度和促进高电压依赖性钙离子内流，对心肌细胞有兴奋作用；β-细辛醚、去甲乌药碱能降低细胞内钙离子浓度，使心肌细胞免受钙超载损伤而具有保护作用。3种单体对心肌细胞钙离子影响作用可相互补偿控制，符合中药方剂学相反相成配伍理论，提示麻黄细辛附子汤既有兴奋心肌细胞的作用成分又有可控制由心肌细胞兴奋所产生的心律失常的成分，可能因此具有综合调控心率的作用。3种单体对心肌细胞功能影响的直接相互作用关系及其机制将进一步研究。

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