高效液相法测定去甲斑蝥素脂质体的包封率

冯 珺 周 峰 周红琴 蔡鑫君 王 增

去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是一种无色结晶性粉末，易溶于水，是新型抗癌药物，用于治疗原发性肝癌、骨髓瘤、消化道肿瘤等，疗效显著，还具有保护肝细胞、调节机体免疫力、升高白细胞的功能[1-4]。然而，该药具有一定的脏器毒性，从而限制了NCTD 在临床上的应用[5]。脂质体是由磷脂和胆固醇为膜材构成的微型泡囊体，作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方面极具潜力。脂质体可通过药物与细胞的相互作用，显著提高药物对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用。本研究以磷脂和胆固醇为主要材料制备去甲斑蝥素脂质体，并采用高效液相（HPLC）法建立去甲斑蝥素脂质体的含量测定方法。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（1260Ⅱ型，Agilent 公司）；色谱柱（Agilent C18：150mm×4.6mm，4μm；安捷伦科技有限公司）；电子天平（CP225D 型，北京赛多利斯仪器有限公司）；数控超声波清洗器（KQ-250DB 型，昆山市超声仪器有限公司）；超声波细胞粉碎机（SCIENTZ-Ⅱ型，宁波新芝生物科技股份有限公司）；去甲斑蝥素原料药（湖北省武汉东康源科技有限公司，批号20161101，纯度≥98%）；去甲斑蝥素脂质体（自制，批号201708）；去甲斑蝥素对照品（中国食品药品检定研究院）。

2 脂质体的制备

根据参考文献采用薄膜分散法制备去甲斑蝥素脂质体[6]。按质量比2：1 称取一定量的磷脂和胆固醇置于烧杯中，加入适量氯仿，超声溶解。将混合溶液置于圆底烧瓶中，在37℃恒温水浴中减压旋转蒸发除去氯仿，待混合溶液在烧瓶壁上成膜后，加入pH6.8 含去甲斑蝥素的磷酸盐缓冲液，继续旋转蒸发水合20min，将上述混合液继续磁力搅拌20min，再用探头短时超声（功率：270W；间歇超声：1s/1s）5min，即得脂质体。

3 含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18 （150mm×4.6mm，4μm）；流动相：乙腈-pH3.1 磷酸水溶液（10∶90）；流速0.8mL/min；检测波长210nm；柱温25℃；进样量20μL。

3.2 溶液制备 对照品溶液制备：精密称取去甲斑蝥素对照品约10mg，置于10mL 容量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度定容。样品溶液制备：制备含药脂质体，并加入适量流动相超声破乳后，再加入流动相稀释定容至刻度，过膜，即得。空白溶液制备：按照样品溶液的制备方法，但不加入去甲斑蝥素，即得。

3.3 方法学考察

3.3.1 专属性试验 分别取去甲斑蝥素对照品溶液、去甲斑蝥素脂质体溶液及空白脂质体溶液适量，以“3.1”项下条件进样操作，记录色谱图。结果显示去甲斑蝥素脂质体溶液主峰的保留时间（4.4min 左右）与对照品溶液主峰保留时间一直，表明去甲斑蝥素脂质体的辅料对去甲斑蝥素测定无影响，方法专属性良好。见图1。

3.3.2 线性与范围 精密量取去甲斑蝥素对照品储备液适量，用流动相稀释成浓度分别为：9.18，45.90，91.80，137.70，183.60，459.00μg/mL 的 去甲斑蝥素对照品溶液。照上述条件操作，以去甲斑蝥素浓度（C）对吸收峰面积（A）做回归方程，得到回归方程为：A=1.5373C-5.0423，r=0.999，结果表明在9.18～459.00μg/mL 范围内去甲斑蝥素浓度与峰面积具有较好的线性关系。

3.3.3 精密度试验 精密移取去甲斑蝥素对照品储备溶液，配制成浓度分别为459、91.8、9.18μg/mL 的去甲斑蝥素溶液，按上述方法测定，每个浓度日内测定3 次，计算日内精密度相对标准差（RSD），分别为0.13%、0.54%、0.65%。由结果可知，精密度均符合方法学要求。

图1 去甲斑蝥素色谱图

3.3.4 重复性试验 取同一批制备的去甲斑蝥素脂质体6 份，依“3.2”项下方法处理样品，照“3.1”项下条件进样，记录峰面积，去甲斑蝥素浓度RSD=1.52%（n=6）

3.3.5 加样回收率试验 精密量取空白脂质体1mL置于10mL 容量瓶中，加入去甲斑蝥素对照品储备液0.5、0.3、0.1mL，各3 份，加入适量流动相超声破乳后，再用流动相稀释定容至刻度，过0.22μm 微孔滤膜，即得供试溶液。照“3.1”项下条件进样，记录峰面积，计算去甲斑蝥素浓度，与实际去甲斑蝥素浓度相比得到加样回收率，所得到的平均加样回收率在98.87%～100.31%，各组的RSD 满足含量测定要求，见表1。

表1 去甲斑蝥素脂质体的加样回收试验结果

3.4 脂质体包封率的测定 按前期课题组预实验和参考文献测定脂质体包封率[7]，精密量取1mL 去甲斑蝥素脂质体适量置于10mL 容量瓶中，加入适量流动相超声破乳后，再用流动相稀释定容至刻度，混匀后过0.22μm 的滤膜，按上述色谱条件进样，检测去甲斑蝥素峰面积，代入回归方程，计算去甲斑蝥素总量（C 总）；精密取去甲斑蝥素脂质体适量置于离心管中，高速离心（15000r/min）30min，取上清液1mL 置于10mL 容量瓶中，再用流动相稀释定容至刻度，混匀后过0.22μm 的滤膜，按上述色谱条件进样，检测去甲斑蝥素峰面积，代入回归方程，计算游离的去甲斑蝥素（C 游），包封率=（C 总-C 游）/C 总×100%。计算得到去甲斑蝥素脂质体的包封率为25.53%。

4 讨 论

去甲斑蝥素是从斑蝥中提取并人工合成的一种新型抗癌药物。虽然毒性比其他斑蝥素低，但还是具有一定的毒性，并且在水中的溶解度较差，生物利用度也较低。因此，为了更好地发挥去甲斑蝥素的抗肿瘤活性，本研究将去甲斑蝥素制备成脂质体。脂质体作为一种药物载体，具有靶向性、长效性，能降低药物毒性、提高药物的稳定性。去甲斑蝥素脂质体可以使药物剂量减少，毒性降低，肾毒性降低。

脂质体的制备方法有注入法、薄膜分散法、逆相蒸发法和冷冻干燥法等。本研究中的脂质体采用薄膜分散法制备，制备工艺简单，易于操作。本研究脂质体中包封率测定采用离心法，利用游离药物与含药脂质体的重力差异进行分离，计算包封率。但离心法需要将脂质体长时间暴露于高速离心机中，离心力会导致脂质体中药物的渗漏，因此药物的包封率不高。另外脂质体溶解度大，其形成时内外水相中的药物可迅速达到平衡，导致包封率偏低。

包封率是脂质体研究的主要内容，提高包封率一直是脂质体研究中的热点和难点。随着对脂质体研究的深入，针对脂质体包封率影响因素，研究人员设计出几种提高包封率的方法，如前体药物法，pH梯度法等具有很高的实用性[8-10]。因此，深入研究包载过程中药物与脂质体膜相互作用，将成为新的技术和方法的理论依据，促进脂质体作为药物载体的开发和使用。