乳铁蛋白对环磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保护作用

李朝霞，张秋霞，赵晖，汪平

（1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.北京东明共成医药科技有限公司，北京 100069）

乳铁蛋白对环磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保护作用

李朝霞1，张秋霞1，赵晖1，汪平2

（1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.北京东明共成医药科技有限公司，北京 100069）

摘 要：探讨乳铁蛋白对环磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保护作用。Balb/c小鼠随机分为6组，正常对照组，模型对照组，乳铁蛋白组（5、25、50、500 mg/kg）。连续灌胃给药27 d，第27天给药后除正常对照组外，其他小鼠均腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，继续灌胃至第30天，末次给药24 h后，放射免疫分析方法测定各组小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞。酶联免疫分析方法检测血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10的变化。与正常对照组相比，模型小鼠外周血CD4+T、CD8+T百分率明显增加；血清 IFN-γ明显降低（p<0.01），IL-4明显增高（p<0.05），IFN-γ/IL-4比值明显下降（p<0.01）；乳铁蛋白25、50、500 mg小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞百分率明显降低（P<0.01或P<0.05）。乳铁蛋白500 mg组小鼠血清IFN-γ较模型组明显增高（p<0.05），乳铁蛋白50、500 mg小鼠血清IFN-γ/IL-4比值趋于正常。乳铁蛋白能不同程度修复环磷酰胺所致小鼠免疫失衡状态，具有免疫保护作用。

关键词：乳铁蛋白；环磷酰胺；免疫功能

乳铁蛋白是由中性粒细胞分泌，为非血红素铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族。对于其功能研究最早开始于其结合铁的特性的研究。近年研究表明，乳铁蛋白具有免疫调节、增强铁的传递和吸收、促进肠道菌群的平衡、广谱的抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等多种生物功能活性[1-2]。

本实验旨在研究乳铁蛋白对环磷酰胺所致免疫损伤小鼠的T细胞亚群及Th1和Th2型细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10）的影响，为乳铁蛋白的免疫活性研究提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级Balb/c小鼠，雌雄兼用，6周～8周龄，体质量18 g～22 g，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2006-0009。

1.1.2 药物及试剂

乳铁蛋白由日本NRL制药股份有限公司提供；环磷酰胺为山东普德药业股份有限公司产品；小鼠CD4+T、CD8+T放免检测试剂盒由北京华英生物技术研究所提供；小鼠细胞因子 IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10检测试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供。

1.1.3 主要仪器

r-911全自动放免计数仪：中国科技大学实业总公司生产；Biofuge15R低温离心机：Heraeussepatech（德国）；JA-1003电子分析天平：上海精科天平厂；Multiskan MK3型酶标仪：ThermoLabsystem公司（芬兰）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理

67只小鼠随机分为6组：正常对照1组10只、正常对照2组10只、乳铁蛋白5 mg/kg11只、25 mg/kg 11只、50 mg/kg13只、500 mg/kg12只。各给药组按不同剂量给乳铁蛋白，灌胃容积为0.2mL/10 g小鼠。正常对照1组与正常对照2组灌胃给等容量的生理盐水，每天给药1次。连续给药27 d，第27天给药后除正常对照1组外，其他5组小鼠均腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，环磷酰胺注射后继续灌胃至第30天，末次给药后次日，取材，检测。

1.2.2 指标检测

末次给药后，动物禁食12 h，麻醉取血，分离血清，放射免疫分析方法测定各组大鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞。酶联免疫分析方法检测血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10 的变化。

1.2.3 统计方法

运用SPSS 13.0 for windows进行数据统计分析，计量资料采用描述，行单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法进行。

2 结果

2.1 乳铁蛋白对环磷酰胺处理小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞的影响

乳铁蛋白对环磷酰胺处理小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞的影响，结果见表1。

表1 各组小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞的比较（±s）Table 1 Comparison of CD4+T，CD8+T Cells in Peripheral Blood of Mice（±s）

表1 各组小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞的比较（±s）Table 1 Comparison of CD4+T，CD8+T Cells in Peripheral Blood of Mice（±s）

注：与模型组对比**P<0. 01；*P<0.05。

分组 只数浓度/（mg/kg） CD4+T/% CD8+T/% CD4+/CD8+/%空白对照组 9 36.04±3.53**29.69±2.26** 1.21±0.06模型组 10 46.76±4.34 39.27±5.62 1.20±0.10乳铁蛋白 11 5 46.55±4.26 39.81±3.37 1.17±0.04乳铁蛋白 12 25 37.24±5.68**31.91±5.26** 1.17±0.04乳铁蛋白 11 50 40.12±4.73**33.34±3.47** 1.20±0.07乳铁蛋白 13 500 42.38±4.56* 34.81±5.80* 1.23±0.13

从表1可以看出，与正常对照组比较，环磷酰胺处理小鼠外周血CD4+T、CD8+T百分率均明显增加；乳铁蛋白25、50、500 mg可不同程度降低环磷酰胺处理小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞百分率（P<0.01或P<0.05）。

2.2 乳铁蛋白对环磷酰胺处理小鼠Th1/Th2类细胞因子的影响

乳铁蛋白对环磷酰胺处理小鼠Th1/Th2类细胞因子的影响，结果见表2。

表2 各组小鼠血清细胞因子变化（±s，n=10）Table 2 Changes of Serum Cytokines in Mice（±s，n=10）

表2 各组小鼠血清细胞因子变化（±s，n=10）Table 2 Changes of Serum Cytokines in Mice（±s，n=10）

注：**p<0. 01；*p<0.05与模型组相比。

分组浓度/（mg/kg）IFN-γ/（pg/mL）IL-2/（pg/mL）IL-4/（pg/mL）IL-10/（pg/mL）IFN-γ/IL-4正常组 133.31±30.14** 29.00±9.03* 42.32±6.40** 54.44±10.56 3.19±0.66**模型组 105.27±24.57 40.04±12.81 59.99±11.85 55.07±11.85 1.76±0.27乳铁蛋白 5 120.53±17.53 29.31±5.11* 58.93±9.54 46.60±7.98 2.08±0.36乳铁蛋白 25 109.73±15.01 36.20±5.90 60.29±8.71 47.42±12.85 1.84±0.29乳铁蛋白 50 113.26±18.62 39.71±8.44 53.97±15.67 51.08±10.76 2.28±0.89*乳铁蛋白 500 130.01±28.02* 35.39±14.10 55.95±6.45 55.67±16.97 2.36±0.62*

从表2可以看出，模型小鼠血清Th1类细胞因子IFN-γ 明显降低（p＜0.01）；IL-2 明显增高（p＜0.05）；乳铁蛋白500 mg组小鼠血清IFN-γ较模型组明显增高（p＜0.05）；乳铁蛋白5 mg组小鼠血清IL-2明显降低，较模型组差异显著（p＜0.05）。

模型小鼠血清Th2类细胞因子不同程度增高，特别是IL-4较正常组差异显著（p＜0.05）；乳铁蛋白5、50、500 mg小鼠血清Th2类细胞因子IL-4、IL-10有降低趋势，但与模型组比较，均无显著性差异。

模型组小鼠血清IIFN-γ/IL-4比值较正常小鼠明显降低（p＜0.01），与模型组相比，乳铁蛋白 50、500 mg组小鼠血清IFN-γ/IL-4比值明显增高（p＜0.05）。结果表明，乳铁蛋白可使环磷酰胺致Th1/Th2平衡漂移有所改善。

3 讨论

外周淋巴细胞亚群的稳定是维持机体正常免疫调节功能所必需的，是评估机体细胞免疫功能的重要指标。Balb/c小鼠为常用的近交系小鼠，其外周血淋巴细胞约占白细胞总数的60%～80%，这一特点有利于观察乳铁蛋白对环磷酰胺处理小鼠淋巴细胞的影响。CD4+T细胞为辅助性T细胞，可产生多种细胞因子，传递抗原信息，促进T和B淋巴细胞增殖分化，辅助B细胞产生抗体和诱导迟发型超敏反应，在免疫应答中主要起调节作用；CD8+T细胞为抑制性和杀伤性T细胞，有免疫抑制和细胞毒作用，可抑制CD4+T细胞和B细胞功能，通过自身及抑制因子在免疫反应中起调节作用[3]。本研究表明，环磷酰胺处理小鼠外周血CD4+、CD8+T细胞百分率均明显增加，乳铁蛋白25、50、500 mg可降低小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞百分率。结果提示乳铁蛋白对淋巴细胞具有一定的保护作用。

辅助性T细胞（Th）在调节细胞免疫和体液免疫反应中起关键作用，根据分泌细胞因子的不同，Th细胞分为Th1与Th2两种类型。Th1/Th2细胞因子对细胞免疫和体液免疫均有重要的调节作用。感染性疾病，自身免疫病，过敏性疾病，移植排斥反应中，均伴有Th1/Th2免疫调节失衡。IFN-γ和IL-4可以分别代表Th1和Th2免疫应答的水平，IFN-γ生物学功能主要为诱导Th细胞向Th1细胞分化，提高Th1细胞数量及其活力；拮抗IL-4诱导B淋巴细胞增殖及产生IgE、IgG；调节抗原递呈细胞参与抗原递呈和特异性免疫识别过程。IL-4主要促进B细胞的增殖，活化和分化；促进T细胞向Th2型细胞分化；拮抗IFN-γ的分泌和功能。IFN-γ/IL-4的比值变化可代表Th1/Th2免疫平衡状况[4-6]。

本次实验结果显示，环磷酰胺处理小鼠血清Th1类细胞因子IFN-γ明显降低；Th2类细胞因子IL-4明显增高；IFN-γ/IL-4比值明显下降，由此可以判定环磷酰胺胺处理小鼠存在明显的Th1/Th2免疫调节失衡，乳铁蛋白50、500 mg对Th1/Th2免疫应答有一定的影响，可通过提高IFN-γ/IL-4比值，促进Th1/Th2免疫平衡的重建，完成其对免疫功能的调节作用。

乳铁蛋白是一种具有多种生物功能活性的蛋白质，相关研究表明，乳铁蛋白具有促进抗体生成、T细胞成熟、淋巴细胞增殖、活化自然杀伤细胞等多种免疫调节功能[7]。乳铁蛋白对机体的免疫调节作用具有深远的应用前景。

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[1]胡志和,庞广昌,陈庆森.牛乳铁蛋白及乳铁素的生产与应用现状[J].食品科学,2006,27(6):247-251

[2]胡志和,刘传国,庞广昌,等.乳铁素免疫调节功能评价[J].食品科学,2009,30(15):200-204

[3]吴亚娣.Th1/Th2细胞的表面受体及其功能调节[J].上海免疫学杂志,2000,20(5):318-320

[4]顾国浩,彭群新.Th1/Th2细胞的免疫功能变化及其意义[J].国外医学:临床生物化学与检测学分册,2003,24(6):333-334

[5]胡志和,刘传国,庞广昌,等.乳铁素免疫调节功能评价[J].食品科学,2009,30(15):200-204

[6]袁颖,金素安,何世民.中药对Th1/Th2细胞因子平衡调节作用的研究进展[J].上海中医药杂志,2011,45(5):90-93

[7]胡志和,李娜,刘传国.乳铁蛋白免疫增强作用评价[J].食品科学,2010,31(11):244-247

Protection of Lactoferrin Aganist Immune Injury of Cyclophosphamide in Mice

LI Zhao-xia1，ZHANG Qiu-xia1，ZHAO Hui1，WANG Ping2
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China；2.Beijing Dong Ming Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Beijing 100069，China）

Abstract：To observe the protection of lactoferrin aganist immune injury of cyclophosphamide in mice.Balb/c mice were randomly divided into six groups——normal group，model group，four doses of lactoferrin groups.The normal group mice were administrated by saline solution without injection of cyclophosphamide.The model group mice were injected cyclophosphamide after intragastric administration of saline solution 27 days continuously.The four doses of lactoferrin groups mice were injected cyclophosphamide（5，25，50，500 mg/kg） through intraperitoneal injection after intragastric administration of correlative dose of lactoferrin 27 days continuously and then administrated by correlative dose of lactoferrin to the 30th days.After the last administration，peripheral blood CD4+T-cells and CD8+T-cells were measured by radioimmunoassay and the levels of serum cytokines of IL-2，IFN-γ，IL-4 and IL-10 were measured by enzyme-linked immunoassay.In comparison with normal group，the percentage of CD4+T-cells and CD8+T-cells were increased ，the levels of serum IFN-γ were decreased obviously （p<0.01），the levels of serum of IL-4 were increased obviously（p<0.05），the ratio of IIFN-γ and IL-4 was decreased obviously （p<0.01） in model group.Peripheral blood CD4+T-cells and CD8+T-cells were decreased obviously in 25 mg/kg and 50 mg/kg as well as 500 mg/kg doses of lactoferrin （P<0.01 or P<0.05）.The levels of serum of IFN-γ were increased obviously in 500 mg/kg dose of lactoferrin in comparison with model group （p<0.05）.The ratio of IFN-γ/IL-4 was inclined to normal level in 50 and 500 mg/kg doses of lactoferrin groups.The lactoferrin had the protection function of restoration of immune imbalance of mice due to cyclophosphamide.

Key words：lactoferrin；cyclophosphamide；immune function

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.032

李朝霞（1977—），女（汉），讲师，博士，研究方向：中药新药的开发与应用。

2012-12-17