ε-聚赖氨酸高产菌的新型筛选模型

孙湘婷，陈娇婷

（赣南医学院，江西赣州 341000）

ε-聚赖氨酸已于2003年10月被FDA批准为安全的天然生物防腐剂[1]。日本窒素公司已将ε-聚赖氨酸的微生物发酵实现工业化，市场规模达数十亿日元[2]。但目前国内还处于实验室研发阶段，主要是进行ε-聚赖氨酸产生菌的诱变选育筛选高产菌株及发酵调控研究。传统的ε-聚赖氨酸高产菌株筛选方法是通过菌株的平板分离获得大量纯培养物，然后随机对每个纯培养物进行摇瓶发酵测定产量，从而筛选获得高产菌株。传统筛选方法工作量十分庞大繁琐且盲目随机。ε-聚赖氨酸高产菌株的筛选方法有两种：一种是在SG培养基中加入0.002%美蓝，该方法简单直观，但美兰对ε-聚赖氨酸产生菌产生很大的抑制作用，因此限制了其应用[3-5]。另一种方法是通过在培养基中加入S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC），筛选得到抗AEC的高产菌株，但AEC价格十分昂贵，研究的AEC需要量较大，因此成本太高也限制了其应用[6-10]。本文提供一种简单、直观、经济、快速的ε-聚赖氨酸高产菌的筛选模型，克服了传统筛选模型的不足，大大地提高了筛选效率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株S.albulus KCTC 9669 中国工业微生物菌种保藏中心；溴酚兰、百里酚蓝、溴百里酚蓝、中性红、甲基红、酚红、甲酚红、酚酞、百里酚酞、NaH2PO4·2H2O、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NH4Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、明 矾 、H3BO3、K2HPO4、KH2PO4、甘油 国药集团化学试剂有限公司；亮蓝、柠檬黄、诱惑红、苋菜红 上海染料研究所有限公司；亚硝基胍 东京化成工业株式会社；AEC SIGMA公司；酵母浸出粉、麦芽浸出粉、葡萄糖、琼脂 上海源聚生物科技有限公司；平板及斜面培养基（%）酵母浸出粉0.4，麦芽浸出粉1.0，葡萄糖0.4，pH7.3；SG固体培养基（%）[3]甘油1，琼脂2，酵母浸出粉0.01，NaH2PO4·2H2O 0.0884，MgSO4·7H2O 0.025，（NH4）2SO40.066，痕量矿物溶液（培养基体积/矿物溶液体积=100/14），适量指示剂，pH7.0；痕量矿物溶液（%）NaCl 0.01，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.01，NH4Mo7O24·4H2O 0.001，CuSO4·5H2O 0.001，CoCl2·6H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，明矾0.001，H3BO30.001；种子及发酵培养基（M3G）[6]（%）葡萄糖5，（NH4）2SO41，K2HPO40.08，KH2PO40.136，MgSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 0.004，FeSO4·7H2O 0.003，酵母浸出粉0.5，pH6.8。

1.2 实验方法

1.2.1 新型筛选模型指示剂的选择 SG固体培养基中加入各指示剂溶液，使培养基中各指示剂终浓度均为0.002%，混匀后倒入90mm平板，制成各指示剂平板。将浓度为1g/L ε-聚赖氨酸标准品溶液200μL加入各指示剂平板的牛津杯中，以无菌蒸馏水为对照，1d后观察平板。

1.2.2 新型筛选模型指示剂浓度的确定 SG固体培养基中加入终浓度为0.0002%～0.0040%的指示剂，将菌株S.albulus KCTC 9669的单孢子悬浮液适当稀释，涂至各浓度的指示剂平板中。30℃培养箱静置培养，观察平板菌落生长情况。根据平板上菌落的生长情况及致死率确定添加指示剂的最佳浓度。

1.2.3 新型筛选模型的验证 从亚硝基胍（NTG）诱变后的两个指示剂平板A和B中各挑取透明圈径大小不一的菌株进行摇瓶发酵，30℃培养4d。比较透明圈径大小与菌株摇瓶发酵的ε-聚赖氨酸相对产量之间的关系。

2 结果与分析

2.1 新型筛选模型指示剂的选择

图1 新型筛选模型指示剂的选择Fig.1 The selection of indicator for the new screening method

表1 新型筛选模型指示剂的选择Table 1 The selection of indicator for the new screening method

由图1和表1可得，在中性红平板上，装有ε-聚赖氨酸标准品的牛津杯周围形成一个十分清晰明显的色素透明圈。在诱惑红、苋菜红、亮蓝、柠檬黄、溴酚兰平板上，装有ε-聚赖氨酸标准品的牛津杯周围形成较清晰明显的色素聚集圈。在酚红、酚酞、百里酚酞、甲基红、甲酚红、百里酚蓝、溴百里酚蓝平板上也形成色素聚集圈，但不清晰，界限不明显。由于中性红平板所形成的色素透明圈最清晰，且界限最明显，所以选择中性红为新型筛选模型的指示剂。

2.2 新型筛选模型指示剂浓度的确定

中性红的浓度太低，所形成的透明圈就不清晰，界限不明显；而浓度太高又会对菌体的生长产生一定的抑制作用，因此须确定合适的指示剂浓度，保证所形成的透明圈既清晰明显又不会对菌体的生长造成较大的抑制作用。由表2可知，当中性红浓度为0.0015%时，所形成的透明圈清晰明显，而且对菌体生长影响很小（其中作为对照的0.002%的亚甲基兰平板对菌的抑制率为91.8%，且第九天长出单菌落）。因此确定新型筛选模型中性红终浓度为0.0015%。

表2 新型筛选模型指示剂浓度的确定Table 2 The determination of the concentration of indicator in new screening method

2.3 新型筛选模型的验证

建立的新型筛选模型是否可靠，需要验证ε-聚赖氨酸产生菌所形成的透明圈径大小与ε-聚赖氨酸相对产量是否正性相关。由表3可知，同一平板上透明圈径越大的菌株其ε-聚赖氨酸相对产量就越高。

表3 新型筛选模型的验证Table 3 The testament of new screening method

3 结论

采用新型筛选模型可以通过目测直观地从中性红平板上筛选出ε-聚赖氨酸高产菌，而不用进行繁琐的摇瓶发酵筛选，大大减小筛选工作量，提高了筛选效率；也不用采用昂贵的AEC，节约了成本，既经济又高效，为ε-聚赖氨酸产生菌株和高产菌株的筛选工作提供了方便。

[1]Shih IL，Shen MH，Van YT.Microbial synthesis of poly（epsilon-polylysine）and its various applications[J].Bioresour Technol，2006，97（9）：1148-1159.

[2]Kahar P，Kobayashi K，Iwata T，et al.Production of epsilonpolylysine in an airlift bioreactor（ABR）[J].J Biosci Bioeng，2002，93（3）：274-280.

[3]Nishikawa M，Ogawa K.Distribution of microbes producing antimicrobial epsilon-poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel method[J].Appl Environ Microbiol，2002，68（7）：3575-3581.

[4]段杉，朱伟珊.ε-聚赖氨酸生产菌的筛选[J].食品与发酵工业，2007，33（8）：14-17.

[5]张超，张东荣，贺魏.一种简便的ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法[J].山东大学学报，2006，44（11）：1104-1107.

[6]朱宏阳，徐虹，吴群.ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定[J].微生物学通报，2005，32（5）：127-130.

[7]岩田敏治，白石慎治，岩泽由美子，等.大量产生ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法：日本，CN97182253.0[P].2000-7-12.

[8]陈玮玮，朱宏阳，徐虹.ε-聚赖氨酸高产菌株选育及分批发酵的研究[J].工业微生物，2007，37（2）：28-30.

[9]余明洁，田丰伟，范大明，等.高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的复合诱变选育研究[J].食品工业科技，2008，29（7）：99-104.

[10]吴琼，唐华，宋光明.天然食品防腐剂ε-聚L-赖氨酸高产菌株的筛选[J].食品工业科技，2005，26（10）：90-92.