SAMHD1蛋白单克隆抗体的制备及SAMHD1在不同细胞中的表达鉴定

戈 曼，吴星亮，尹 鑫，魏 萍，王晓钧*

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室，黑龙江哈尔滨 150001）

SAMHD1为鼠γ干扰素诱导基因Mg11的类似物，具有脱氧核苷三磷酸水解酶的功能，最近被鉴定为人免疫缺陷病毒（HIV-1）的限制性因子[1]。SAMHD1在树突状细胞和其他髓系细胞中呈高表达状态，并通过干扰病毒DNA的高效合成抑制前期的病毒复制，具有先天免疫功能。SAMHD1同时与一种以慢性脑脊髓炎流质淋巴细胞增多症的病因有关[2]，能够增高IFN-α的水平[3]。huSAMHD1基因全长约1 878 bp，其编码的huSAMHD1可以降解巨噬细胞内的大部分dNTP，在低水平的dNTP环境中HIV-1的反转录和cDNA的形成过程被有效抑制，而且HIV-1不能够感染髓系细胞[4-5]。而HIV-2和相关的免疫缺陷病毒（SIVsm/mac）则能够通过其编码的Vpx蛋白降解SAMHD1，从而越过骨髓细胞内的保护机制感染易感动物[6]。本研究通过原核表达huSAMHD1可溶性重组蛋白huSAMHD1，制备抗huSAMHD1的单克隆抗体（MAb），为深入研究SAMHD1的功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 重组质粒、细胞及实验动物 原核及真核表达SAMHD1的重组质粒 pET-huSAMHD1、pcDNA-huSAMHD1（人）和 pcDNA-eqSAMHD1（马）及 pcDNA-macSAMHD1（猴）由本实验室构建；人单核细胞（THP-1）和人白血病细胞（U937）购自中国医学科学院基础医学研究所；SP2/0、293T、兔肾细胞、马及驴皮肤细胞由本实验室保存；BALB/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂 HAT选择性培养基、HT选择性培养基、弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FICA）、IRD标记的羊抗鼠IgG（IRD-IgG）、羊抗鼠荧光二抗（FITC-IgG）及PEG-4000均购自Sigma公司；HiTrapProteinG HP购自GE公司；羊抗鼠HRP-IgG、兔抗鼠SAMHD1 MAb购自Abcam公司；抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotechnology公司。

1.3 huSAMHD1蛋白的表达与纯化 将pET-huSAMHD1转化于E.coliRosetta中，在15℃诱导16 h进行huSAMHD1的表达，经镍柱纯化，并以兔抗鼠 SAMHD1（1∶5 000）为一抗，羊抗鼠 IRD-IgG（1∶10 000）进行 western blot鉴定。

1.4 动物免疫 将纯化的huSAMHD1与等体积的FCA乳化，经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠（100 ug/只）。以后每间隔2周将免疫原与等体积的FICA乳化进行免疫，共免疫3次。在三免后一周用不加佐剂的抗原加强免疫（100 ug/只）。3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。

1.5 间接ELISA检测方法的建立 以huSAMHD1作为包被抗原，采用棋盘滴定法建立检测杂交瘤细胞培养液的间接ELISA方法，以P/N值大于2.1的抗原和抗体稀释度作为两者的最佳工作浓度。

1.6 细胞融合及杂交瘤细胞的筛选 将免疫鼠的脾细胞与SP2/0采用PEG-4000进行融合，利用建立的ELISA方法进行筛选。并进行阳性细胞克隆纯化。

1.7 腹水的制备及效价的测定 具体步骤按照参考文献[7]的方法，并采用HiTrapProteinG进行纯化。

1.8 MAb免疫球蛋白亚类鉴定 利用抗体亚类鉴定试剂盒对MAb进行亚类鉴定。

1.9 MAb的鉴定 将pcDNA-huSAMHD1利用磷酸钙方法转染293T细胞，转染48 h后收集细胞并将其裂解，以羊抗鼠HRP-IgG作为二抗（1:40 000），对MAb进行western blot鉴定。

1.10 MAb的间接免疫荧光（IFA）鉴定 具体步骤按照参考文献[8]的方法。

1.11 SAMHD1在不同细胞中的表达鉴定 采用western blot分别检测人、猴、马表达重组质粒转染293T细胞的真核表达产物与未转染的293T及空载体转染的293T细胞作为阴性对照，并分别检测其他种属细胞的反应情况。

2 结果及讨论

2.1 huSAMHD1原核表达、纯化及western blot鉴定 将重组菌在15℃诱导16 h后，huSAMHD1获得到大量的可溶性表达，纯化的huSAMHD1经SDS-PAGE和western blot鉴定结果显示，其分子约为79 ku，与预期相符（图1）。

图1 纯化重组蛋白的SDS-PAGE及western blot分析Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of purified protein

2.2 杂交瘤细胞株的建立 免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后，经间接ELISA筛选及4次细胞克隆纯化，获得1株能稳定分泌抗huSAMHD1蛋白的杂交瘤细胞株，命名为huSAMHD1MAb。

2.3 MAb效价及MAb免疫球蛋白亚类鉴定 经间接ELISA测定huSAMHD1 MAb在4代细胞培养后上清液及腹水效价最高分别为 1:640，1:106，huSAMHD1 MAb亚型为IgG2b/κ链。

2.4 MAb的western blot鉴定 用huSAMHD1MAb检测pcDNA-huSAMHD1转染293T细胞的真核表达产物。检测结果表明，huSAMHD1MAb可以识别表达产物，其大小与huSAMHD1蛋白（79 ku）相符，而且与空载体转染293T细胞的表达产物呈阴性反应（图 2）。

图2 MAb对huSAMHD1在293T细胞中表达的western blot鉴定Fig.2 Identification of the MAb to huSAMHD1 expressed in 293 cells by western blot

2.5 MAb的IFA鉴定 将pcDNA-huSAMHD1转染293T细胞，以羊抗鼠FITC-IgG为二抗，对制备的MAb杂交瘤细胞上清液进行鉴定。检测结果显示，MAb与huSAMHD1真核表达的蛋白呈阳性反应。

图3 MAb对huSAMHD1在293T细胞中表达的IFA鉴定Fig.3 Identification of the MAb to huSAMHD1 expressed in 293 cells by IFA

2.6 SAMHD1在不同细胞中的表达鉴定 采用huSAMHD1 MAb分别检测人、猴、马SAMHD1重组质粒转染293T细胞的表达产物，以未转染的293T细胞及空质粒转染的293T细胞作为阴性对照，同时检测马、驴皮肤细胞、兔肾细胞、THP-1和U937细胞SAMHD1的表达情况。检测结果表明，huSAMHD1 MAb只识别pcDNA-huSAMHD1转染的293T细胞表达的huSAMHD1以及天然表达huSAMHD1的THP-1细胞，目的蛋白约79 ku，而与猴、马pcDNA-SAMHD1和空质粒转染的293T细胞以及马、驴皮肤细胞、兔肾细胞、293T和U937细胞均无特异性反应（图4）。

人、猴及马SAMHD1序列比对显示，其同源性达到90%，商品化的抗huSAMHD1 MAb可以与猴、马SAMHD1的真核表达蛋白反应。本研究利用原核表达系统表达的huSAMHD1制备的MAb仅具有识别相同种属的SAMHD1特异性，而与其他种属的SAMHD1无交叉反应，表明该MAb具有良好的种属特异性，为进一步研究huSAMHD1分子的功能提供有效的工具。

图4 huSAMHD1 MAb特异性鉴定及SAMHD1在不同细胞中的表达鉴定Fig.4 Specific identification of the MAb in different cells by western blot

[1]Stetson D B,Ko J S.Trex1 prevents cell-intrinsic initiation of autoimmunity[J].Cell,2008,134（4）:587-598.

[2]Powell R D,Holland P J,Hollis T,et al.Aicardi-Goutières syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase[J].JBiolog Chem,2011,286（51）:43596-43600.

[3]Rice G I,Bond J,Asipu A,et al.Mutations involved in Aicardi-Goutie`res syndrome implicate SAMHD1 as regulator of the innateimmune response[J].Nature Genet,2009,41:829-832.

[4]Laguette N,Sobhian B,Casartelli N,et al.SAMHD1 is the dendritic-and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx[J].Nature，2011,474:654-657.

[5]Hrecka K.Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection ofmacrophagesmediated by the SAMHD1 protein[J].Nature,2011,474:658-661.

[6]Bergamaschi A,Ayinde D,David A,et al.The human immunodeficiency virus type 2 Vpx protein usurps the CUL4ADDB1DCAF1 ubiquitin ligase to overcome a postentry block in macrophage infection[J].JVirol,2009,83:4854-4860.

[7]王凌风，杨涛，孙恩成，等.蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定[J].中国预防兽医学报，2011，33（6）：465-470.

[8]鲁絮，张彦明，郑增忍，等.抗猪瘟病毒NS3（p80）蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J].中国预防兽医学报，2008，30（6）：464-468.