五指山小型猪内源性反转录病毒囊膜基因变异特征研究

张 念，马玉媛，向思龙，贾俊婷，吴健敏，章金刚

（1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062；2.军事医学科学院野战输血研究所国家生物医学分析中心/病毒安全检测实验室，北京 100850；3.广西壮族自治区兽医研究所，广西南宁 530001）

猪内源性反转录病毒（Porcine endogenous retrovirus，PERV）是与猪→人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。体外研究已证明PERV能够感染人源细胞[1]，这一发现引起了人们对异种移植病原安全性的广泛关注。

PERV属于反转录病毒科哺乳动物C型反转录病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组全长为8.1 kb～8.9 kb，由5'非编码区、种群特异性抗原（gag）基因、聚合酶（pol）基因、囊膜（env）基因及3'非编码区组成，gag、pol基因相对env基因具有较高保守性，env基因主要决定其感染范围及细胞嗜性[2]。

五指山小型猪具有体型小、遗传稳定、耐粗饲等国外小型猪不可比拟的优点[3]，其基因组中PERV的基因序列拷贝数较低[4]，有望为异种移植提供合适供体。本实验室在前期研究初步表明：五指山来源的PERV-env序列中存在着较多的G→A突变。因此，本实验在前期研究基础上以连续3代次近交系五指山小型猪为研究对象，对其来源的PERV env基因变异特征（G→A突变）进行深入研究。此研究有助于PERV分子特性的研究，也一定程度上为猪→人异种移植中的病毒安全性评价提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 连续3个代次（F18、F19、F20）近交系五指山小型猪耳组织（每代次3个样品，共9个样品），来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。

1.2 主要试剂 rTaqDNA聚合酶、dNTP（10mM）、dATP（100mM）、DL2000/5000Marker、SalⅠ、XbaⅠ等购自TaKaRa公司；phusion高保真DNA聚合酶购自NEB公司；胶回收试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒、TOP10感受态细胞购自Tiangen公司；基因组DNA纯化试剂盒购自Promega公司。

1.3 样品处理 将猪耳组织剪碎后放进经液氮预冷的研钵中，研磨成粉末状。使用基因组DNA纯化试剂盒提取样品基因组DNA，并测其浓度及纯度。

1.4 引物设计与合成 根据GenBank中本实验室登录的五指山来源的PERV-A序列（EF133960），设计一对引物用于PERV-env基因扩增，产物为1981bp。PERV-envF： 5'-GATCCATGCATCCCACGTTA-3'，PERV-envR：5'-CCGGTCAGTTTCTCCTTAGC-3'，由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。

1.5 PERV-env基因的扩增、克隆及测序 以五指山小型猪耳基因组DNA为模板，进行PERV-env基因扩增及克隆。从每个样品中随机选取3个阳性克隆进行测序。

1.6 生物信息学分析 以本实验室在GenBank登录的五指山小型猪PERV（EF133960）序列env基因为参考序列，用DNAMAN软件进行序列比对。根据 GenBank登 录 的 PERV（PERV-A：AJ293656、AJ279056； PERV-B： AY099324、 AY056035；PERV-C： AF038599、 AF038600； PERV-A/C：AY570980、AY953542）env基因序列，用Clustalx W（DNAStar软件包）进行多重序列比对，使用MEGA4软件对PERV-env基因进行遗传进化分析。

2 结果与讨论

2.1 PERV-env基因扩增 利用常规PCR方法扩增得到PERV-env基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示与预期大小（1 981 bp）相符（图1）。

2.2 五指山小型猪PERV-env基因序列分析 实验共获得27条PERV-env核苷酸序列，其同源性为97.1%～99.5%，与参考序列同源性为98.3%～99.3%。序列比对结果表明：每代次小型猪PERV-env序列中均存在碱基突变，G→A突变数目明显多于其他碱基突变数目（表1），最多可达40个，突变率最高可达60.43%（表2），并且发生位置偏好于GA、GG即负链TC、CC，此突变偏好位点与Harris RS[5]和Patric J等[6]研究结果（G→A突变偏好发生于负链TC、CC）一致。

猪APOBEC3F（pA3F）是猪体内唯一的一种APOBEC家族蛋白分子，该家族分子主要作用于病毒复制过程中的负链cDNA链，导致C→U的突变，造成病毒无法正常复制或导致病毒缺陷死亡，从而起到抗病毒作用[7]。结合本室前期对pA3F的研究[8]以及国外相关报道[9-10]，推测PERV-env序列中G→A突变可能是pA3F作用的结果。

对连续3代次五指山小型猪PERV-env序列G→A突变数目进行单因素方差分析表明：3代次小型猪之间PERV-env序列G→A的突变数目并无明显差异（p>0.05）。分析其原因可能为pA3F对PERV的作用具有长期累积效应，此效应还待进一步研究。此外，序列分析表明，与参考序列相比，五指山小型猪来源的PERV-env序列190 bp及1 875 bp位置均存在G→A突变，此结果有助于PERV分子变异机制的进一步研究。

表1 近交系连续3代五指山小型猪PERV-env序列中碱基突变数目（中位数）Table 1 The number of basemutationin in PERV-env sequences from WZSPs（median）

表2 近交系连续3代五指山小型猪PERV-env序列中G→A的突变数目Table 2 The number of G→A mutation in PERV-env sequences from WZSPs

对五指山猪来源的与其他小型猪来源的PERV-env序列进行多重序列比对，结果显示五指山猪来源的PERV-env序列与PERV-A、B、C、A/C亚型env序列同源性分别为96.7%～98.9%、76.4%～77.7%、84.9%～85.7%、84.9%～95.8%。遗传进化树显示PERV-A、B、C 3种亚型明显地分为3支，本实验中五指山猪来源的PERV与国外小型猪来源的PERV-A亚型亲缘关系最为接近，但仍存在一定差异（图1）。

本实验对五指山小型猪来源的PERV-env基因进行G→A突变研究，有助于深入研究pA3F对五指山猪来源的PERV复制的影响及作用机制，为进一步开展异种移植中PERV的安全性评价奠定基础，对于我国特有小型猪的开发利用具有重要意义。

图1 连续3代次五指山小型猪PERV-env基因系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on PERV-env gene of three consecutive generations of WZSPs

[1]Patience C,Takeuchi Y.Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs[J].Nat Med,1997,3（3）:282-286.

[2]Takeuchi Y,Patience C,Magre S,et al.Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus[J].J Virol,1998,72（12）:9986-9991.

[3]Wu Jian-m in,Ma Yu-yuan.Large-scale survey of porcine endogenous retrovirus in Chinese Miniature pigs[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2008,31（4）:367-371.

[4]Ma Yu-yuan,Yang Y X,Lv Mao-m in,et al.Real-time quantitative PCR with SYBR Green Idetection for estimating copy numbers of porcine endogenous retrovirus from Chinese Miniature pigs[J].Transplant proc,2010,42（5）:1949-1952.

[5]Harris R S,Bishop K N.DNA deam ination mediates innate immunity to retroviral infection[J].Cell,2003,113（6）:803-809.

[6]Jern P,Stove J P,Coffin J M.Role of APOBEC3 in genetic diversity among endogenous murine leukem ia viruses[J].PloS Genet,2007,10（3）:2016-2022.

[7]Jonsson S R,LaRue R S,Stenglein MD,et al.The restriction of zoonotic PERV transmission by human APOBEC3G[J].PloS One,2007,2（9）:e893.

[8]孙宇，罗佳，等.猪APOBEC3F基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定[J].第三军医大学学报，2011，19：384-387.

[9]Jonsson S R,Hache G,Stenglein MD,et al.Evolutionarily conserved and non-conserved retrovirus restriction activities of artiodactyl APOBEC3F proteins[J].Nucleic Acids Res,2006,34（19）:5683-5694.

[10]Dorrschuck E,Fischer N,Bravo I G,et al.Restriction of porcine endogenous retrovirus by porcine APOBEC3 cytidine deam inases[J].JVirol,2011,85（8）:3842-3857.