我国东北地区野生鸟类A亚群禽白血病病毒分子流行病学调查及env基因序列分析

杨 波，高玉龙，高宏雷，秦立廷，刘婉思，李德龙，高 奇，曾祥伟，王笑梅*

（1.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001；3.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000）

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的以造血细胞恶性增生为主的一类C型反转录病毒群（或肿瘤病毒群），包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞白血病和髓细胞样白血病[1]。根据病毒的宿主范围及交叉中和试验等将ALV分为A～J 10个亚群，其中A亚群ALV（ALV-A）是禽白血病的主要病原体，以引发淋巴细胞瘤为主[2-3]。国内外众多学者在不同时间段分别鉴定了鸡群中ALV-A感染的存在，并且测定了鸡群中ALV-A分离株基因组序列。然而，以往的流行病学调查主要针对家禽和水禽，关于野鸟感染ALV-A的研究甚少，为了对野生鸟类ALV的流行情况和病毒分子特征进行研究，我们先后对在我国东北地区采集的野生鸟类样品进行检测，并对野鸟中ALV-A阳性样品进行env基因的序列分析。

1 材料和方法

1.1 病毒株与被检样品 被检样品采集自东北地区300只死亡野生鸟类，其中绝大部分来自各鸟类环志站保存的网捕过程中意外死亡的野鸟，一部分是林业主管部门处罚没收的非法猎杀的鸟类，一部分来自各疫源疫病监测站在巡查过程中发现已死亡的鸟类。野鸟的种类主要为雁形目中的野鸭和雀形目中的各种小型鸟类。在生物安全实验室内进行野生鸟类剖检，采集肝、脾等组织脏器。

1.2 主要试剂TaqDNA聚合酶、dNTP、ALV-p27抗原检测试剂盒购自IDEXX公司；T4 DNA连接酶、pMD18-T载体购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒、Plasm id Miniprep Kit和 DNA Gel Extraction Kit购自AxyGen公司；抗ALV群特异抗原p27的兔血清由哈尔滨兽医研究所惠赠；FITC标记的羊抗兔 IgG（IgG-FITC）购自Sigma公司；感受态细胞DH5α为本实验室保存。

1.3 引物设计及合成 根据文献由北京六合华大基因科技股份有限公司合成4对引物ALV-AF/ALV-AR[4]、 ALV-BF/ALV-BR[5]、 ALV-JF/ALV-JR[6]和ALVAENVF/ALVAENVR[7]。

1.4 病毒分离与检测

1.4.1 病毒分离培养野生鸟类组织研磨液病料处理具体步骤参照文献[6]。

1.4.2 ALV-p27 ELISA抗体检测按照试剂盒的说明书操作，以间接ELISA方法检测采集的样本的ALV-Ab抗体

1.4.3 间接免疫荧光试验（IFA）采用第3代病毒细胞培养物接种于DF1细胞中培养5 d，参照文献[6]的方法以ALV群特异抗原p27的兔血清作为一抗，以羊抗兔IgG-FITC为二抗（1∶150），进行IFA鉴定。

1.4.4 样品PCR鉴定以第3代病毒细胞培养物提取的总DNA为模板，按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，-20℃保存备用。以ALV-AF/ALV-AR、ALV-BF/ALV-BR、ALV-JF/ALV-JR 3对引物分别对样品进行PCR检测，进行ALV的亚群鉴定。

1.5env基因序列的扩增、克隆和序列分析 对检测ALV-A阳性的样品以ALVAENV F/ALVAENV R引物PCR扩增env基因，条件为：95℃5m in；95℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 3 Min，30个循环；72℃10m in。PCR产物克隆入pMD18-T载体中，由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。用DNAStar、Clustal X和MEGA 4.0软件进行序列分析。

2 结果与讨论

2.1 病料样品中ALV的分离和检测 采用ALV-p27 ELISA对收集的300份野鸟肝或脾组织研磨液样品检测，其中有两份样品呈阳性反应。

2.2 IFA检测结果 用ALV群特异抗原p27的兔血清做IFA结果显示，上述ALV-p27 ELISA阳性反应的两份样品在IFA检测中也均呈阳性。可见胞质中有色荧光、胞核无荧光的典型感染细胞（图1）。

图1 阳性样品感染DF1细胞的IFA结果（100×）Fig.1 The result of IFA of DF1 cellw ith positive samples（100×）

2.3 样品PCR检测结果 用扩增ALV-A、ALV-B和ALV-J 3对特异性引物进行PCR鉴定。结果表明，用ALV-A引物扩增的两份样品的片段与阳性对照大小一致（图2），ALV-B和ALV-J两对引物扩增没有特异性片段，进一步证明分离的病毒为ALV-A。分别命名为WB11031株和WB11149株。

图2 样品PCR检测结果Fig.2 PCR result of the samples

2.4 序列分析 经DNAStar软件分析，分离株WB11031和WB11149的gp85基因开放阅读框大小均为1 020 bp，编码340个氨基酸残基。与鸡的不同亚群ALV的参考株同源性比较表明，两株分离株的氨基酸序列与ALV-A的氨基酸序列同源性最高，为 91.1%～100%。而与 B、C、D、E、J亚群ALV的gp85编码序列的同源性仅为28.0%～80.3%。同时，gp85基因系统进化树分析结果表明，两株分离株均属于ALV-A（图3）。两株分离株的gp85基因与其他代表株比较存在点突变，其中分离株WB11031为C194T和T927C；分离株WB11149为T764C和A1002T，但均为沉默突变。两株分离株与美国MQNCSU株氨基酸序列相近。gp37基因较为保守，各病毒株氨基酸同源性为91.1%～92.1%，无缺失或插入突变。

现已知全世界有8条主要候鸟迁徙路线，中国湿地水鸟的迁徙路线主要分为东部、中部和西部3条路线[8]。经证明：分离株WB11031为来自赤颈鸭（Eurasian W igeon），分离株WB11149为来自绿翅鸭（Green-w inged Teal），赤颈鸭和绿翅鸭均属于雁形目（Anseri-formes）。据报道ALV主要通过垂直传播感染雏鸡，表现为持久的病毒血症，造成免疫抑制[9]，所以该病毒可能对野生鸟类也存在类似危害。另外，候鸟种类和数量繁多，迁徙覆盖面积广泛，更有可能加剧家禽感染和传播禽白血病的危险性。

本文首次对野生鸟类感染ALV-A的情况进行检测和调查，结果显示我国东北地区野生鸟类存在ALV感染。虽然野生鸟类ALV检出率比较低（0.06%），但野鸟ALV的检测分析是一项重要的基础工作，积极开展这一研究，有助于对ALV的生态分布、传播扩散规律以及遗传进化等问题的深入研究。另外野生鸟类在越冬迁徙时是否作为该病毒的携带传播媒介，传染给迁徙途径地及最终目的地的家禽，或与家禽之间进行相互传播还有待进一步研究。

图3 WB11031和WB11149与鸡的不同亚群ALV参考株间gp85遗传进化树关系Fig.3 Phylogenetic tree based on gp85 gene for ofWB11031,WB11149 and chicken ALV reference strains of different subgroups

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