具抗病毒活性的重组牛IFN-αA的冷激诱导表达与鉴定

孙旭燕，崔子寅，高明春，王君伟

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

干扰素α（IFN-α）属于Ⅰ型干扰素，是一组能够诱导一系列细胞内蛋白表达继而发挥抗病毒、抗细胞增殖和调节免疫应答的细胞因子。自80年代初，人IFN-α基因被克隆报道后，鼠、狗、猪、牛和羊等哺乳动物的IFN-α基因也相继被克隆报道，牛α干扰素（BoIFN-α）的研究始于上世纪 80年代中期，研究表明BoIFN-α可以抵抗多种病毒的增殖与复制，因此日益为人们所重视。

E.coli表达系统是应用最广泛的表达系统之一。然而，BoIFN-α在E.coli表达系统中多以无生物学活性的包涵体形式存在。因此，利用E.coli表达系统表达出具有生物学活性的BoIFN-α更具生产与应用价值。本研究将BoIFN-αA亚型基因（BoIFN-αA）融合在易于表达的融合标签NusA末端[1]；同时利用内含肽元件（Ssp DnaB Mini-intein，SDI）介导的自我剪切反应自动去除融合标签，纯化重组蛋白[2]；应用冷激启动子表达系统降低蛋白质的合成速率，促进二硫键的正确装配，提高重组蛋白的可溶性表达[3]，构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusASDI-BoIFN-α，实现了 rBoIFN-αA的高效可溶性表达，为rBoIFN-α在我国实现规模化生产及临床应用提供有意义的依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞、菌株及质粒 牛病毒性腹泻病毒（BVDV 1型NADL株）效价为TCID50=10-4.4/0.1m L、牛肾细胞（MDBK）细胞株、重组质粒pWL-BoIFN-α（IFN-α基因已经密码子优化，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）[4]、E.coli感受态细胞TG1、DH5α、Rosetta以及 pET载体、pTW INⅠ、pColdⅢ均由东北农业大学动物医学学院微生物教研室保存。

1.2 主要试剂BsaⅠ、T4连接酶购自NEB公司；其他酶类购自TaKaRa公司；Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；DL 2000 PlusⅡDNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；High Affinity Ni-Charged Resin购自GenScript公司；蛋白标准分子量Marker购自Fermentas公司；兔源抗BoIFN-α多抗血清由本实验室制备并保存；HRP标记山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 引物设计及合成 根据BoIFN-α的cDNA序列及pTW INⅠ载体上的SDI基因序列设计引物，为避免外源氨基酸干扰重组蛋白的表达和活性，在BoIFN-α基因的上游和SDI基因的下游引入BsaⅠ限制性内切酶识别位点，从而使扩增的两段PCR产物能够融合为一个ORF。引物序列为：Sen-SDI：5'-C AGTGGTACCGCTATCTCTGGCGATAGTC-3'（KpnⅠ）；Antisen-SDI：5'-GGTCTCGTTGTGTACAATGATGTC A-3'（BsaⅠ）；Sen-Bo：5'-AGCATAGGTCTCAACAAC TGCCATCTGCCGCATACCCATA-3'（BsaⅠ ）； Antisen-Bo：5'-AGCTCTCGAGTTAATCTTTGCGACGA-3'（XhoⅠ），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 SDI和Bo IFN-α 基因的扩增及串联 以pTW INⅠ质粒为模板，用Sen-SDI和Antisen-SDI引物进行PCR扩增。扩增条件为：94℃5min；94℃30 s、53.8℃ 30 s、72℃ 1 Min，25个循环；72℃5 Min。用KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切PCR回收产物，克隆于经同样酶切的pET-30a（+）载体中构建重组质粒，命名为pET-30-SDI。

以pWL-BoIFN-α为模板，用Sen-Bo和Antisen-Bo引物进行PCR扩增。扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s、55.7℃ 30 s、72℃ 1 min，25个循环；72℃ 5 Min。用BsaⅠ和XhoⅠ双酶切PCR回收产物和上步所得的pET-30-SDI，构建重组质粒pET-30-SDI-BoIFN-α，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.5 SDI-Bo IFN-α与融合标签NusA的串联 以pET-30-SDI-BoIFN-α为模板，Bam-SDI（5'-CTAGG GATCCGCTATCTCTGGCGATA-3'，下划线处为BamHⅠ位点）为上游引物，Antisen-Bo为下游引物， PCR扩增SDI-BoIFN-α串联序列。扩增条件为：94℃5m in；94℃30 s、58.1℃30 s、72℃1m in，30个循环；72℃ 5 min。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切PCR回收产物与pET-43.1a（+）载体，构建重组质粒 pET-43.1-SDI-BoIFN-α。

1.6 内含肽-冷激表达重组质粒的构建与鉴定用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切 pET-43.1-SDI-BoIFN-α和pColdⅢ载体，构建重组质粒 pColdⅢ-NusA-SDIBoIFN-α，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.7 重组蛋白的诱导表达及表达形式分析 将pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α转化入Rosetta中，将重组菌接种在LB培养液中（含Amp 100μg/mL），37℃培养至OD600nm达0.6～0.8时加入IPTG至终浓度为1mmol/L，16℃诱导24 h。分别取诱导菌离心后的沉淀和上清进行SDS-PAGE检测表达产物。

1.8 重组蛋白的的western blot鉴定 将菌体超声后上清按常规方法进行SDS-PAGE、转膜、封闭，一抗为兔源抗BoIFN-α多抗血清，二抗为HRP标记羊抗兔IgG，对重组蛋白进行western blot分析，将鉴定正确的重组蛋白命名为NS-BoIFN-α。

1.9 NS-Bo IFN-α的纯化及定量 诱导后菌体，根据High Affinity Ni-Charged Resin蛋白纯化说明在非变性条件下纯化可溶性蛋白；进行SDS-PAGE，检测NS-BoIFN-α纯化结果。经Bradford法定量纯化的NS-BoIFN-α的蛋白浓度。

1.10 NS-Bo IFN-α抗病毒活性测定 将4倍倍比稀释的NS-BoIFN-α100μL，分别加入96孔板培养MDBK单层中，37℃孵育24 h后分别加入100TCID50的BVDV 100μL，同时设空白细胞对照组、病毒对照组，待病毒对照组完全病变时观察NS-BoIFN-α处理的细胞病变（CPE）情况。以抑制50%CPE的最高干扰素稀释度为1U[5]计算其抗病毒活性。

2 结 果

2.1 SDI和Bo IFN-α 基因的扩增及串联 以pTW INⅠ质粒为模板，PCR扩增出约500 bp的基因片段（图1A），大小与SDI基因相符。扩增产物酶切后连接到 pET-30a（+）载体。以 pWL-BoIFN-α为模板，PCR扩增出约500 bp的特异条带（图1B），与预期的目的片段大小相符。扩增产物酶切后连接pET-30-SDI。pET-30-SDI-BoIFN-α经酶切和测序鉴定正确（图 1C）。

2.2 内含肽-冷激表达重组质粒的构建与鉴定以pET-30-SDI-BoIFN-α为模板，经PCR扩增出约1 000 bp的SDI-BoIFN-α基因片段（图2A），与预期SDI-BoIFN-α串联基因大小相符。扩增产物酶切后连接pET-43.1a（+）载体，重组质粒 pET-43.1-SDIBoIFN-α经酶切鉴定（图2B），所得目的片段与SDIBoIFN-α串联基因大小相符。pET-43.1-SDI-BoIFN-α通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，获得连接有Nus和6His等标签的基因片段NusA-SDI-BoIFN-α，将其连入pColdⅢ载体，经酶切鉴定（图2C）和测序分析，证明载体构建正确。

图2 重组质粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α的构建及鉴定Fig.2 Construction and identification of recombinant plasmid pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α

2.3 重组蛋白的表达、鉴定及纯化 SDS-PAGE检测，对照菌Rosetta（pColdⅢ-NusA-SDI）表达出约70 ku大小的条带，构建的重组菌表达了约为90 ku的重组蛋白，与理论值相符，并且表达的重组蛋白主要以可溶形式存在（图3A）。

Western blot结果显示，菌体超声后上清可以与BoIFN-α多抗血清在目的条带处发生特异性反应，表明表达蛋白为BoIFN-α（图3B）。

非变性条件下，用镍柱亲和层析纯化NS-BoIFN-α，250 mmol/L的咪唑基本能够将目的蛋白洗脱下来，纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE检测（图 3C）。经 Bradford法定量纯化的 NS-BoIFN-α 浓度为0.12mg/mL。

2.4 NS-Bo IFN-α的抗病毒效果分析 抗病毒活性试验结果表明：细胞对照组生长良好（图4A），NS-BoIFN-α处理组细胞能够抵抗100TCID50的病毒攻击（图4B），而病毒对照组细胞全部死亡（图4C）。经过计算，纯化后的NS-BoIFN-α抗BVDV活性为9.86×105U/mg（表 1）。表明纯化获得的 NS-BoIFN-α具有较好的抗病毒活性。

图3 重组蛋白的表达及纯化Fig.3 Analysis of recombination protein and purification of NS-BoIFN-α

图4 NS-BoIFN-α对BVDV的抑制作用（200×）Fig.4 Inhibition of NS-BoIFN-αon BVDV cultivated in MDBK cells（200×）

表1 NS-BoIFN-α在MDBK细胞上的抗病毒活性检测Table 1 Activity of NS-BoIFN-αin MDBK cells

3 讨 论

目前，E.coli仍然是最简便、廉价、应用最广泛的表达系统之一，但rBoIFN-α在E.coli中极易产生包涵体，而后期的蛋白重新折叠工作繁琐、重叠蛋白的生物学活性不确定，重叠和纯化后蛋白的总产量降低。孙仰峰等采用计算机辅助软件基因优化BoIFN-α的方法优化表达了具有抗病毒活性的BoIFN-α蛋白，但产物仍以包涵体的形式存在[4]。所以，本研究利用内含肽-冷激诱导表达系统表达出了可溶性的rBoIFN-α具有重要的应用价值。

本研究中采用了一系列优化措施使rBoIFN-α在E.coli中实现了高效可溶性表达：（1）选择NusA融合标签。Harrison通过将可溶性重组蛋白模型改良，证明了NusA蛋白是在E.coli中具有最高可溶性的3种蛋白之一[6]，NusA形成的重组蛋白不仅表达量比其他重组蛋白高，而且其助溶效果也最为显著[7]。此外，NusA还可以间接指导分子内二硫键的形成和重组蛋白的正确折叠[8]。（2）选用pColdⅢ低温表达载体。pColdⅢDNA通过利用一种来自E.coli自身在低温诱导时产生的cspA启动子[9]，可以使E.coli在16℃低温条件下表达重组蛋白。（3）N端融合SDI内含肽。内含肽可以促进重组蛋白的可溶性表达，提高目的蛋白的含量。本研究表达的蛋白中目的蛋白所占的比例为62.7%，而崔子寅等利用含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的重组质粒pMAL-SDI-BoIFN-α表达的目的蛋白占菌体总蛋白的比重为54.1%[10]，这表明综合应用以上3种可溶性表达优化措施，可以明显提高目的蛋白表达量。

SDI除了具有助溶的作用外，还具有诱导自我剪切的活性[11]，使融合标签与目的蛋白分离。目前在本研究中已证明内含肽具有助溶的作用，诱导内含肽产生自我剪切的活性还在摸索当中，利用内含肽的自我剪切机制表达无冗余氨基酸的人IFN-α已有先例[12]，所以通过进一步的条件优化有望将rBoIFN-α的目的基因从内含肽的C端切割下来，真正实现无冗余氨基酸BoIFN-α的可溶性表达。

Charleston等研究表明细胞病变型BVDV（cpBVDV）可以诱导Ⅰ型干扰素的产生，从而干扰cpBVDV的复制[13]，本研究利用MDBK-BVDV干扰素活性检测系统证明BoIFN-α抵抗BVDV的活性为9.86×105U/mg，在细胞水平证明了BoIFN-α可以有效抵抗BVDV对MDBK的攻击，同时也证明连接内含肽和NusA融合标签的表达系统能够表达具有较高抗病毒活性的重组IFN-α，为今后大量生产具有抗病毒活性的rBoIFN-α奠定了基础。

本研究利用pColdⅢ冷激诱导表达载体及NusA融合标签利于可溶性表达的特点，结合内含肽的助溶作用，获得了高表达量、高活性的可溶性的rBoIFN-α，为开发并应用BoIFN-α资源，进而预防和控制牛病毒性疾病提供了物质基础。

[1]M itra A,Chakrabarti K S,Shahul Hameed MS,et al.High level expression of peptides and proteins using cytochrome b5 as a fusion host[J].Protein Expr Purif,2005,41（1）:84-97.

[2]Perler F B.InBase:the intein database[J].Nucleic Acids Res,2002,30（1）:338-384.

[3]Weickert MJ,Doherty D H,Best E A,et al.Optim ization of heterologous protein production inEscherichia coli[J].Curr Opin Biotechnol,l996,7（5）:494-499.

[4]孙仰峰，李文辉，李勐，等.牛IFN-α基因高效表达及纯化的研究[J].中国预防兽医学报，2008，30（11）：799-892.

[5]吴志光，夏春，汪明，等.QIA express系统高效表达鸡γ干扰素cDNA的研究[J].中国农业大学学报，2002，7（3）：89-93.

[6]Harrison R G.Expression of soluble heterologous protein via fusion w ith NusA protein[J].Mater Res Innovations,1999,11（1）:4-7.

[7]侯鑫，扈廷茂，刘俊娥.在大肠杆菌中表达有活性的人STK11蛋白[J].微生物学报，2007，47（1）：79-82.

[8]Davis G D,Elisee C,Newham D M,et al.New fusion protein systems designed to give soluble expression inEscherichia coli[J].Biotechnol Bioeng,1999,65（4）:382-388.

[9]刘薇.小牛凝乳酶基因在大肠杆菌中可溶性表达研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2008.

[10]崔子寅，王艺萌，唐博，等.内含肽和麦芽糖结合蛋白介导具有抗病毒活性牛α干扰素的表达[J].中国兽医科学，2012，42（05）：523-528．

[11]Derbyshire V,Wood DW,Wu Wei,et al.Genetic definition of a protein-splicing domain:Functional Mini-inteins support structure predictions and a model for intein evolution[J].Proc Natl Acad Sci,1997,94（11）:466-471.

[12]Yan Shou-sheng,Yan Juan,Shi Gang,et al.Production of native protein by using Synechocystis sp.PCC6803 DnaB Miniintein inEscherichia coli[J].Protein Expr Purif,2005,40:340-345.

[13]Charleston B,Fray MD,Baigent S,et al.Establishment of persistent infection w ith non-cytopathic bovine viral diarrhea virus in cattle is associated w ith a failure to induce type I interferon[J].JGen Virol,2001,82:1893-1897.