多伞阿魏挥发油提取工艺及化学成分研究

2013-08-28雷林洁于富生王长虹

中成药 2013年6期

雷林洁，滕亮，，赵欣，于富生，王长虹

(1.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011;2.新疆华圣元医药科技有限公司，新疆乌鲁木齐830011;3.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，上海 201203)

阿魏为伞形科阿魏属植物新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen或阜康阿魏Ferula fukanensisK.H.Shen的树脂。主要分布于地中海、中亚及其邻边地区。我国约有26种1变种，主产于新疆。阿魏药材是从阿魏属植物的根或茎中得到的一种油胶树脂。阿魏性苦、辛，温。归肾、胃经，具有杀灭血吸虫［1］、镇痛和戒断的抑制作用［2］、抗溃疡［3］、抗过敏［4］、抗菌作用［5］、抗炎作用［6］等功效。阿魏的化学成分主要是树脂、树胶、挥发油、多糖等，其中含挥发油约10% ～17%，树脂约40% ～64%，树胶约25%［7］。阿魏有香阿魏、臭阿魏之分，臭阿魏主要包含新疆阿魏、阜康阿魏与五彩阿魏。其他阿魏多为香阿魏，主要分布在乌恰、裕民、米泉、木垒、奇台、石河子等地。上世纪70年代后，新疆阿魏和阜康阿魏被破坏的相当严重，目前阜康阿魏已灭绝，全疆目前仅在拜什墩山区还有少量的野生新疆阿魏。香阿魏为伞形科植物多伞阿魏Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov的树脂或根，在新疆资源分布广泛，在维吾尔、哈萨克等民族中常代替臭阿魏入药。本实验优选了多伞阿魏挥发油的提取工艺，采用GC-MS对其挥发油化学成分进行了分析，并考察提取时间对阿魏挥发油化学成分的影响，为多伞阿魏的进一步开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器气相色谱仪 (GC-2010 Plus，日本岛津);气质联用仪 (Agilent 7890 A-5975C型，美国);电子天平 (BS110S，北京赛多利斯天平有限公司);智能恒温电热套 (DRT-SX型，郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试药多伞阿魏 (产地新疆奇台县，20111001，由新疆华圣元医药科技有限公司于富生主任药师鉴定为多伞阿魏根的树脂);乙酸乙酯(天津市化学试剂一厂，20010408);甲醇 (天津市致远化学试剂有限公司，20110916);丙酮 (天津永晟精细化工有限公司，20111020);无水硫酸钠 (天津市天达净化材料精细化工厂，050810)，以上试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 多伞阿魏挥发油提取工艺的研究［18］

2.1.1 考察指标以阿魏油提取率为指标对阿魏挥发油的提取工艺进行研究。

2.1.2 多伞阿魏挥发油相对密度测定将多伞阿魏挥发油按照2010年版《中国药典》一部附录XD“密度测定法”中的“比重瓶法”进行测定，计算挥发油密度，测定多伞阿魏挥发油平均密度为0.886 4 g/mL，RSD为0.001%(n=3)。

2.1.3 均匀试验优选阿魏挥发油最佳提取工艺在单因素试验的基础上，以阿魏挥发油提取率为考察指标，采用U7(72)均匀试验设计，考察溶剂倍数和提取时间对提取率的影响，因素水平见表1，试验方案及结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Table of levels and factors

将试验结果采用均匀设计回归分析及优化系统(UROS)进行处理，得回归方程:Y=2.187 1+1.868 6X1－0.082 6X2－0.206 7X12+0.035 7X1X2。回归方程显著性检验的F=96.683，复相关系数r2=0.999 9(P＜0.05)。

表2 U7(72)均匀试验设计方案及结果Tab.2 Arrangement and the results of U7(72)uniform design

优化条件为:X1(提取时间)=5.71 h;X2(加水量)=13.84倍，理论最大预测值为7.80%，预测区间为7.36%～8.24%。

2.1.4 验证试验分别称取3份阿魏50 g，加入14倍水，提取5.5 h，冷却，计算提取率。

结果平均挥发油提取率为7.77%，RSD为0.34%，说明多伞阿魏挥发油提取工艺 (工艺Ⅰ)稳定、合理、可行。

2.2 多伞阿魏挥发油化学成分的研究

2.2.1 多伞阿魏挥发油气相质谱分析

2.2.1.1 样品制备方法称取多伞阿魏50 g，加入14倍蒸馏水，提取5.5 h，冷却，收集挥发油，采用无水硫酸钠干燥，得淡黄色挥发油，备用。分别精密量取各份样品挥发油1 mL，置10 mL量瓶中，丙酮定容至刻度，即得。

2.2.1.2 气相色谱质谱分析条件［9-13］气相色谱条件:气质联用仪 (Agilent 7890 A-5975C型，美国);HP-5MS毛细管色谱柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为高纯氮气;载气流量为 1 mL/min;进样量0.5 μL;分流比30∶1;进样器250℃;检测器250℃;升温程序为起始温度为60℃，保持2 min，以2℃/min的速率程序升温至80℃，保持5 min，最后以4℃/min升温至180℃，保持5 min。

质谱条件:电离方式EI;电离能量70 eV;离子源发生器温度230℃;质量扫描范围30～350 amu。

2.2.1.3 气相色谱质谱分析结果阿魏挥发油的气相色谱图见图1，总离子流图见图2。采用面积归一化法计算出各组分的相对百分含有量，经CAS数据库检索，确定了多伞阿魏挥发油的基本化学成分，共鉴定出44种化合物，其中主要成分为(1R)-(+)-蒎烯 (3.64%)、莰烯 (4.68%)、β-蒎烯 (2.28%)、3-蒈烯 (4.15%)、D-柠檬烯(9.08%)、异松油烯 (3.00%)、(1S，2S，4R)-醋酸-1，3，3-三甲基-双环［2.2.1］庚烯-2-醇(3.13%)、左旋乙酸冰片酯 (17.78%)、 (E)-β-金合欢烯 (11.26%)、α-法尼烯 (7.48%)、反式-橙花叔醇 (6.33%)、愈创木醇 (11.44%)，未检出多硫化合物。分析鉴定结果见表3。

图1 多伞阿魏挥发油气相色谱图Fig.1 GC chromatogram of volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

图2 多伞阿魏挥发油总离子流图Fig.2 TIC of volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

2.3 提取时间对多伞阿魏挥发油化学组成的影响［14］

2.3.1 气相色谱条件气相色谱仪 (GC-2010 Plus，日本岛津);HP-5MS毛细管色谱柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为高纯氮气;载气流量为1 mL/min;进样量0.5 μL;分流比50∶1;总流量54.0 mL/min;压力80.9 kPa;进样口温度250℃;升温程序为起始温度为60℃，保持2 min，以4℃/min的速率程序升温至80℃，保持5 min，以4℃/min的速率程序升温至180℃，保持5 min，最后以4℃/min的速率程序升温至200℃。

2.3.2 挥发油样品制备称取多伞阿魏8份，每份50 g，加入14倍蒸馏水，提取时间分别为1、2、3、4、5、6、7、8 h，冷却，收集挥发油，采用无水硫酸钠干燥，备用。

2.3.3 气相色谱分析结果分别进样2.3.2项样品0.5 μL，1 h样品气相色谱图见图3。以提取1 h挥发油色谱为参比色谱，采用Excel2003软件计算不同提取时间挥发油的色谱行为与提取1 h挥发油色谱行为的相似性［15］，结果见表4。进一步对气相色谱中主成分色谱峰峰面积变化进行分析，结果见图4～图6。

图3 提取1 h挥发油样品气相色谱图Fig.3 GC chromatogram of volatile oil extracted at 1 h

图4 不同提取时间对成分1～7的峰面积的影响Fig.4 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area of compounds 1-7 in volatile oil

图5 不同提取时间对成分8～9的峰面积的影响Fig.5 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area of compounds 8-9 in volatile oil

由图4～6可知，多伞阿魏挥发油色谱中化学成分1～7对热不稳定，成分8～9为对热较稳定挥发性成分，而提取时间的延长则有利于主成分10～12的提取。

2.3.4 验证试验提取时间对多伞阿魏挥发油化学组成的影响研究表明，提取时间超过5 h挥发油化学组成种类减少，因此根据工艺Ⅰ的条件设计单因素实验，考察提取时间为4 h时不同加水量对提取率的影响。根据单因素试验结果得挥发油优选提取条件 (工艺Ⅱ)，试验结果见表5。

表3 多伞阿魏挥发油化学成分分析结果Tab.3 Constituents and its percentage contents in volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

表4 不同提取时间多伞阿魏油化学成分色谱相似度评价Tab.4 Evaluation of similarity of the GC chromatogram of volatile oil extracted at different time

图6 不同提取时间对成分10～12的峰面积的影响Fig.6 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area ofcompounds10-12 in volatile oil

表5 验证试验结果 (n=3)Tab.5 Results of validation test(n=3)

上述结果表明优选提取条件 (工艺Ⅱ)为加入药材14倍水，提取4 h，挥发油平均提取率为8.02%，RSD为0.09%，说明多伞阿魏挥发油提取工艺稳定、合理、可行。

与工艺Ⅰ的验证试验结果 (平均挥发油提取率为7.77%，RSD为0.34%)相比较，两种提取条件所得挥发油的提取率相近。但是根据提取时间对挥发油化学组成影响的研结果可知提取时间超过5 h挥发油化学组成种类减少，说明工艺Ⅱ不仅能确保挥发油的量，同时也能确保挥发油化学组成的稳定性，因此工艺Ⅱ是更为理想的多伞阿魏挥发油提取工艺条件。

3 讨论

3.1 多伞阿魏的前处理多伞阿魏呈脂膏状，黏稠，具持久的臭味，不易称取。冷冻干燥、减压干燥均不易除去其水分。为了保证试验的准确性，便于物料称量，在提取前将阿魏树脂于－18℃冷冻24 h，药材成块状，韧性下降，脆度增加，此时则极易粉碎。

3.2 GC-MS测定多伞阿魏挥发油化学成分文献调研表明新疆阿魏挥发油因含多硫化合物而具蒜臭味［10］，而多伞阿魏挥发油GC-MS分析结果表明鉴定出的44种化合物中不含多硫化合物，与提取物无蒜臭气味相一致。鉴定出的化合物成分组成及主要成分的百分含有量与文献报道的香阿魏化学成分［16-19］不完全一致，这可能与产地、采期、测试仪器的条件有关。鉴定出的化合物中主要成分为单萜及倍半萜类衍生物，该类化合物多具有消炎抗菌及解痉镇痛作用［7］，这有可能是多伞阿魏在民间药用的物质基础之一。

3.3 多伞阿魏挥发油化学成分随着提取时间的动态变化本实验借鉴指纹图谱相似度评价的方法，以提取1 h的挥发油色谱图作为参比色谱，利用简便易行的Excel 2003软件进行样品气相色谱峰的相似度计算，结果表明挥发油提取时间不宜超过5 h。当挥发油提取时间超过5 h，无论是相关系数还是余弦夹角均出现较为明显的下降。进一步分析提取时间对气相色谱主成分色谱峰峰面积的影响，结果提示12个主成分中成分1～7为对热不稳定挥发性成分，随着提取时间的延长含有量有下降的趋势，成分8～9为对热较稳定挥发性成分，提取时间的变化对含有量影响不是很明显，而提取时间的延长则有利于成分10～12的提取，可能是因为这类成分对热稳定、分子量大、沸点高、气化蒸发所需能量较大的缘故。以上分析提示在挥发油提取工艺研究中除了关注挥发油的提取量外，还需关注挥发油质的变化，即提取时间对挥发性成分化学稳定性的影响。

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