护骨胶囊配伍和成骨细胞分化的正交设计

王晓东， 贾欢欢， 曾昭利， 曾 雯， 秦中华， 万 超， 陆幸妍， 李青南，胡 彬

(1.广东药学院附属第一医院骨外科，广东广州 510080;2.广东省实验动物监测所，广东广州 510663;3.东莞万成制药有限公司，广东东莞 523040;4.香港中文大学医学院生物医学学院干细胞与再生医学中心，香港;5.广东药学院生命科学与生物制药学院新药功能研究中心，广东广州 510006;6.纽约大学牙科生物材料和仿生学研究室，美国纽约 10010)

骨质疏松症 (Osteoporosis)是以骨量减少、骨微观结构退化为特征，致使骨的脆性和骨折危险性增加的系列性多病因的一种全身骨骼疾病［1-2］。成骨细胞 (osteoblasts)作为骨形成的主要功能细胞，是目前大多数防治骨质硫松症药物的主要靶细胞之一［3］。其合成分泌的碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase，AKP)被作为考察成骨细胞分化的主要指标［4］。护骨胶囊是在中医理论指导下形成的国家中药新药 (新药证书编号:国药证字Z20040106)，研究发现护骨胶囊对原发性骨质硫松症有一定的防治作用［5］，但临床反馈，老年人服药量略微偏大。本实验采用正交模拟法［6］和非线性混合效应模型 (NONMEM)技术［7-9］，以AKP为考察指标，优化护骨胶囊的配伍组方。

正交模拟法是由上海中医药大学郑青山教授提出，用以定量考察复方各组分的药效贡献及其配伍规律的药效学实验方法。遵循这种规律性设计，可以最少的实验次数获取最优化的复方配伍［10］。

1 材料

1.1 药物与试剂 护骨胶囊十味原药材东莞万成制药有限公司提供;碱性磷酸酶 (AKP)测定试剂盒南京建成生物工程研究所生产，批号:20100630。

1.2 动物 2月龄SD大鼠24只，雌雄各半，体质量 (200±10)g，合格证号:0074494及0074528;SD乳鼠3只，合格证号:SCXK(粤)2008-0020，雌雄兼用，每只约15 g。均由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.3 仪器 Microplate Reader 680酶标仪，美国Biorad公司;J-D200倒置生物显微镜，深圳拓天仪器设备有限公司;Galaxy二氧化碳培养箱，英国RS Biotech公司。

2 方法

2.1 护骨胶囊原方组成 护骨胶囊由以下十味药材组成:淫羊藿 (A)277.5 g，巴戟天 (B)277.5 g，骨碎补 (C)277.5 g，杜仲 (D)277.5 g，续断 (E)277.5 g，制首乌 (F)347.5 g，熟地黄 (G)347.5 g，龟甲 (H)208.5 g，当归(I)208.5 g，山药 (J)277.5 g。

表1 正交设计Tab.1 Orthogonal array

2.2 分组与给药 护骨胶囊十个组分ABCDEFGHIJ按表1设计，组成12个组方，煎煮液浓缩至0.1 g/mL。每组2只大鼠灌胃0.2 mL/(kg·d)，雌雄各半，连续7 d。根据护骨胶囊的成人服用量，按照标准动物的等效剂量折算系数法［11］计算出护骨胶囊原药材的大鼠给药量，可以折算出每组大鼠的给药量，计算结果见表2。各组给药结束后30 min心脏取血，4 000 r/min离心15 min分离大鼠血清，将雌雄大鼠血清混合，采用血清药理学的方法制成10%的含药血清，作用于源自大鼠乳鼠头盖骨的原代培养至第3代的成骨细胞，检测各组470 nm培养成骨细胞上清的AKP吸光度 (A)值［12-13］。数值大代表药效越强。

表2 各组分二水平设置 (g/kg)Tab.2 Set 2 levels of each component(g/kg)

2.3 分析模型与原理［14］采用正交模拟法及NONMEM法评价模型对实验数据进行分析。采用最简单的A、B两组分组方来说明此方法的原理，Eobs为实测效应，E0表示基线效应;Ea和Eb为 A、B组分对复方效应的期望贡献值。

(1)基础模型模型 (式1)，可确定各组分对复方的贡献值大小 (Eexp)，即重要程度。

(2)固定效应模型 (式2)，可确定各配伍组的相互作用 (Eab)。

(3)随机效应模型 (式3)，可分析个体间 (η)和个体内 (ε)变异 (Erand)大小。

(4)复方预测药效模型 (式4)，可预测不同组方的效应 (Epred)，寻找最大药效和最优组方。

2.4 模型评价 采用单组分实验结果及4种常规视图对预测模型进行评价［9］。

3 结果

3.1 成骨细胞形态学观察鉴定 原代细胞贴壁前呈均匀一致的球形，24 h左右开始贴壁，72 h完全贴壁，并且胞浆伸展，呈饱满的多角形。10 d之后出现细胞融合，大多呈立方体形。

3.2 成骨细胞碱性磷酸酶 (AKP)检测 条件培养基可以诱导头盖骨骨髓间充质干细胞转化为成骨细胞，以AKP作为成骨细胞分化的指标，检测发现使用条件培养基培养细胞的上清液470 nm波长的A值0.164 0±0.003明显高于使用普通培养基的A值0.034 3±0.002 1(P＜0.05)。

3.3 护骨胶囊模拟组方对成骨细胞分化的影响与原方 (第1组)比较，所有实验组均有统计学差异 (P＜0.05)，且组4的A值大于组 1，见表3。

3.4 药效学参数分析 复方药效学参数列于下表，以基线效应为标准。应用DAS3.0软件分析12个组的A值，比较各组分“用药”与“不用药”的药效变化，确定各组分的重要性，实为该组分对复方的药效贡献值ED，反映各自重要程度［6］，结果见表4。由表4可以发现，有五味药对成骨细胞分化有促进作用，而骨碎补 (C)、何首乌 (F)对成骨细胞分化无作用 (P＞0.05)，续断 (E)、龟甲 (H)、当归 (I)对成骨细胞分化则有抑制作用(ED＜0);各味药对成骨细胞分化作用的影响大小，排序为淫羊藿 (A) ＞山药 (J) ＞巴戟天(B)=熟地黄 (G)＞杜仲 (D)＞骨碎补 (C)＞何首乌 (F) ＞龟甲 (H) ＞当归 (I) ＞续断(E)。

表3 各组血清培养成骨细胞470 nm A值 (±s，n=3)Tab.3 Absorbance values of each group serum culture osteoblast(±s，n=3)

表3 各组血清培养成骨细胞470 nm A值 (±s，n=3)Tab.3 Absorbance values of each group serum culture osteoblast(±s，n=3)

注:与原方 (第1组)比较，*P＜0.05。

配伍组号 A RSD/%1 0.184 0±0.011 5 6.3 2 0.166 7±0.013 0* 7.8 3 0.158 7±0.006 7* 4.2 4 0.187 0±0.011 5* 6.2 5 0.133 3±0.008 5* 6.4 6 0.158 7±0.010 5* 6.6 7 0.164 0±0.003 0* 1.8 8 0.146 7±0.007 2* 4.9 9 0.157 7±0.007 2* 4.6 10 0.143 0±0.006 9* 4.8 11 0.145 7±0.009 3* 6.4 12 0.141 0±0.007 0*5.0

表4 各组分对复方药效的估计值Tab.4 Pharmacodynamic forecast values of composition

3.5 相互作用分析 不同组合，由于其剂量水平不一，其相互作用性质和程序也有所不同，各配伍相互作用关系见表5。

3.6 复方药效学模型评价 表6是在正交试验12组数据的基础上，采用正交模拟软件DAS3.0对护骨胶囊不同组合的复方进行药效模拟，得出29个模拟组方，并进行评价。通过药效预测值Epred发现，29个预测组中最小效应组合为组2(Epred为0.144 5);最大效应组合为组1(Epred为0.226 3)，其次有5个组合的模拟药效值接近于组1:组11(Epred为0.210 8)，组 15(Epred为0.204 9)，组 17(Epred为0.201 6)，组28(Epred为0.204 4)及组29(Epred为0.217 5)即原方，结果见表6及表7。

表5 不同组分配伍对的实测效应 (Eobs)、期望效应(Eexp)与交互效应 (Eint)Tab.5 Eobs，Eexpand Eintof different compositions

3.7 预测模型评价［14］通过本实验2种视图的结果，说明各配伍组药效均值 (Egroup)与预测值(Epred)的趋势线与标准线吻合较好 (图1)，具有较好的相关性;个体实测值 (Eobs)与个体预测值(Eipred)间关系一致 (图2)。此外，个体实测值(Eobs)与群体预测值 (Epred)的变化趋势一致。

表6 不同组方的药效预测值Epred及其95%CITab.6 Predicted value pharmacodynamics of simulation compound Epredand 95%CI

表7 6个较好的模拟组方Tab.7 Six better simulation compounds of pesticide effect

复方药效学模型具有预测能力，且实验数据离散度小 (在±4内)，具有可预测性。以上均表明所建模型较好，具有预测能力。

4 讨论

当今，骨质疏松症已成为严重威胁人类生活质量的疾病，国家已经将其列为重点攻关的老年三大疾病之一［15］。基于中药护骨胶囊对原发性骨质疏松有良好的临床疗效，本实验对处方配伍的优化将进一步拓宽其应用前景。

本研究以AKP为指标，结合正交模拟法理论上研究护骨胶囊十味药的最佳配伍组合。以护骨胶囊各组分对复方药效的贡献值顺序排列其重要程度，结果显示，淫羊藿药效的理论贡献值大于其他药味的贡献值，进一步证明了淫羊藿作为护骨胶囊君药的科学性。同时，本实验对不同模拟组合的复方进行了药效预测，发现29个模拟组中有6组具有较强的促分化作用:此排列顺序为组方1、29(原方)、11、15、28和17，其中组方1只有原方中的6味药，理论药效最强，其值超过原组方。在组方构成上减少了续断 (E)、龟甲 (H)及当归(I)的组方1与护骨胶囊原方相比，对成骨细胞分化仍有较强的促进作用。

图1 各配伍组药效均值 (Egroup)与预测值 (Epred)的相关性Fig.1 Correlation of efficacy mean(Egroup)and predicted mean(Epred)

图2 个体实测值 (Eobs)与个体预测值(Eipred)间关系Fig.2 Relationships of individual measured values(Eobs)and predicted values(Eipred)

另一方面，根据各味药对护骨胶囊复方药效的理论贡献值，发现续断 (E)、龟甲 (H)及当归(I)对成骨细胞分化有抑制作用 (ED＜0)。

此外，本实验室还采用成骨细胞增殖作为考察指标［16］，利用正交模拟法分析了护骨胶囊十味药在原组方中对成骨细胞增殖的贡献程度，结合本次实验结果进一步分析发现，在原组方中，淫羊藿(A)、巴戟天 (B)、杜仲 (D)、熟地黄 (G)及山药 (J)，这五味药无论对成骨细胞的增殖还是分化都有较强的促进作用;骨碎补 (C)只对成骨细胞增殖有促进作用 (P＜0.05)，而对分化无影响 (P＞0.05);何首乌 (F)对成骨细胞增殖及分化均无影响 (P＞0.05);续断 (E)、龟甲(H)及当归 (I)对分化有抑制作用 (ED＜0)，但对增殖却有一定的促进作用 (P＜0.05)。

从上述正交模拟法分析护骨胶囊各味药的贡献值和不同模拟组合获得复方药效数据，用细胞分化和细胞增殖为指标的各自实验数据并不完全一致，提示护骨胶囊组方优化上还需要中医经验和中医理论相结合分析和合理加减。

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