桂枝茯苓胶囊对动脉粥样硬化大鼠心脏微血管的影响

裴 强， 桑文凤， 赵习德*

(1.新乡医学院第一附属医院，河南卫辉 453100;2.新乡医学院，河南新乡 453000)

由动脉粥样硬化 (atherosclerosis)所导致的心脑血管疾病是严重危害人类健康的一大类疾病，致死率和致残率居所有疾病之首，有“头号杀手”之称。目前对大血管损伤及其机制的研究资料丰富，但对动脉粥样硬化时微血管的结构和功能改变及其分子机制的研究缺乏相关的文献资料。有报道基质金属蛋白-2(MMP-2)参与心脏和动脉重塑［1］，通过下调MMP-2的表达防止心脏扩张，保护心肌收缩力，减轻心肌纤维化［2］。但其与微小血管病变间的关系尚未见报道。本研究通过药物干预动脉粥样硬化模型大鼠，检测其微小血管密度及MMP-2表达的变化，观察桂枝茯苓胶囊对动脉粥样硬化时冠脉微小血管的影响及其可能的作用机制。西药卡托普利［3］和辛伐他汀对动脉粥样硬化均有良好的防治作用，另有报道认为辛伐他汀有促进缺血心肌毛细血管新生的作用，进而保护缺血心肌［4］。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠50只(购于新乡医学院实验动物中心)，7～8周龄，体质量180～230 g。饲养在新乡医学院第一附属医院中心实验室。

1.2 主要药品与试剂 桂枝茯苓胶囊 (江苏康缘药业股份有限公司，批号:100946);辛伐他汀(北京万生药业有限责任公司，批号:20110114);卡托普利 (上海旭东海普药业有限公司，批号:110301);维生素D3针 (上海通用药业股份有限公司，批号:100103);兔抗大鼠平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体、兔抗大鼠层黏素多克隆抗体、兔抗大鼠MMP-2抗体 (北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 造模方法及动物分组 大鼠购回后适应性喂养1周，随机将大鼠随机分成两组。空白组为12只，给予普通饲料喂养;造模组为38只，按文献的方法［5］稍加改进，采用高脂饲料 (配制方法为78.5%普通饲料，1%胆固醇，0.5%猪胆盐，10%熟牛油，10%蛋黄粉)喂养与维生素D3腹腔注射(实验第1周，维生素D3700 000 U/kg，分3次注射，间隔2 d)相结合的方法复制大鼠动脉粥样硬化的模型。两组均喂养8周后各取2只处死，取血及主动脉，测血脂及病理形态学观察，证实造模成功后造模组改为减半高脂的饲料喂养，造模组大鼠随机分为3组，模型组、西药对照组、治疗组，每组12只。

1.4 药物干预 造模成功后开始灌胃给药，时间为6周。药物灌胃前用生理盐水配成溶液。模型组及空白组均给予生理盐水 ［8 mL/(kg·d)］;西药组给予辛伐他汀 ［0.86 mg/(kg·d)］和卡托普利［4.3 mg/(kg·d)］;治疗组给予桂枝茯苓胶囊［0.24 g/(kg·d)］。

1.5 标本采集与制备 各组大鼠禁食、水12 h，0.2%水合氯醛腹腔注射麻醉，心尖取血后快速打开胸腹腔，钝性剥离升主动脉至髂总动脉分叉处并剪断，取出带有胸主动脉的心脏，生理盐水冲洗后置10%中性甲醛溶液中固定。剪取胸主动脉约0.5 cm，心脏保留左心室及室间隔，取垂直于长轴中1/3组织，用不同浓度乙醇逐级脱水，浸蜡、包埋，切片，厚度5 μm，制备成动脉血管横切面做HE染色及心脏横切面做免疫组织化学染色。

1.6 指标检测 免疫组织化学染色法检测大鼠心肌微小动脉密度、毛细血管密度及MMP-2的表达。主要流程 (过氧化物酶标记的链霉卵白素法，即SP法):切片脱蜡、水化，PBS液浸泡，抗原修复，滴加山羊血清工作液，室温孵育。滴加稀释后一抗 (兔抗大鼠)，4℃冰箱过夜。PBS冲洗，滴加生物素化二抗工作液 (生物素标记山羊抗兔)，37℃温箱孵育。PBS冲洗，滴加辣根酶链霉卵白素工作液，37℃温箱孵育。PBS冲洗，滴加DAB显色剂，轻度复染细胞核，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察、拍照。大鼠心肌MMP-2阳性表达的测定采用计算机图像分析系统 (Image-Pro plus)，测量其平均光密度 (MOD)。MOD越高，反映该物质表达越强。每只大鼠均观测6张切片，每张切片随机选取相等的5个高倍视野 (×400)计算其均值。高倍镜下直径小于20 μm的圆形血管，抗平滑肌α-肌动蛋白抗体染色呈棕黄色的是微小动脉;油镜视野下直径小于8 μm的单个核标记的血管，抗层黏素抗体染色呈现为蓝色的是毛细血管;取10个不同视野下的均值，即是其微小动脉密度与毛细血管密度。

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差 (±s)来表示。多组间计量资料采用单因素方差分析;相关性检验采用Pearson相关分析。P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 心肌微小动脉密度、毛细血管密度、MMP-2结果 (表1)空白组可见少量、散在的呈现棕黄色圆形的微小动脉 (图1A)及多个呈现蓝色的毛细血管 (图2A)，模型组可见微小动脉的数量明显增多 (图1B)，毛细血管数量明显减少 (图2B)，微小动脉密度及毛细血管密度与空白组相比有显著性差异 (P＜0.05)，治疗组和西药对照组微小动脉 (图1C、1D)及毛细血管 (图2C、2D)的数量介于空白组与模型组之间。微小动脉密度及毛细血管密度与模型组相比均有显著性差异 (P＜0.05)，但治疗组与西药对照组相比均无显著性差异 (P＞0.05)。空白组心肌MMP-2仅有较浅黄色着色 (图3A);模型组可见整个视野呈现较深的黄褐色 (图3B)，MOD与空白组比较有显著性差异 (P＜0.05);治疗组及西药对照组呈黄色，治疗组染色相对西药对照组稍浅 (图3C、3D)，治疗组、西药对照组MOD与模型组相比均有显著性差异 (P＜0.05)，但两组间无显著性差异 (P＞0.05)。

表1 各组大鼠心肌微小动脉密度、毛细血管密度、MMP-2光密度比较 (±s)Tab.1 Comparison of the arteriole and capillay density，optical density of MMP-2 in myocardium among the groups(±s)

表1 各组大鼠心肌微小动脉密度、毛细血管密度、MMP-2光密度比较 (±s)Tab.1 Comparison of the arteriole and capillay density，optical density of MMP-2 in myocardium among the groups(±s)

注:与空白组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05。

光密度空白组组 别 动物数/只 微小动脉密度/(个·mm－2) 毛细血管密度/(个·mm－2) MMP-2 10 16.82±1.55 2 409.74±388.57 0.10±0.02模型组 12 31.64±3.43* 1 491.99±266.58* 0.24±0.03*西药对照组 12 24.60±2.30＊△ 2 029.52±321.61＊△ 0.17±0.03＊△治疗组 12 24.43±1.79＊△ 2 056.67±190.45＊△ 0.16±0.03＊△

图1 大鼠心肌微小动脉 (免疫组化染色，×400)Fig.1 Arteriole in myocardium in rats in each group(immunohistochemistry staining，×400)

2.2 心肌微小动脉密度、毛细血管密度与MMP-2间相关分析 MMP-2表达与微小动脉密度呈正相关 (r=0.919，P＜0.05)，与毛细血管密度呈负相关 (r=－0.813，P＜0.05)。

3 讨论

图2 大鼠心肌毛细血管 (免疫组化染色，油镜)Fig.2 Capillary in myocardium in rats in each group(immunohistochemistry staining，oil immersion lens)

心肌功能的正常最终需要微循环功能的完整性。近90%的心肌血容量位于毛细血管之内，称为毛细血管血容量［6］。冠脉微血管病变是心肌微小动脉、毛细血管和微小静脉构成的微循环系统发生了结构性改变及功能障碍，是导致冠状动脉血流储备下降的关键［7］。毛细血管周细胞与微小动脉血管平滑肌细胞相延续，并被认为隶属于同一细胞系。某些病理情况下，周细胞可以转化成为血管的平滑肌细胞［8］，而微小动脉的平滑肌细胞也能够迁移至下游的毛细血管壁中，从而使毛细血管转变成微小动脉。

图3 大鼠心肌MMP-2阳性表达 (免疫组化染色×400)Fig.3 Expression of MMP-2 in rats in each group(immunohistochemistry staining，×400)

冠脉微血管病变属中医“络病”范畴。病机多由气血运行不畅，脏腑功能失调，痰阻血瘀络痹。治疗应痰瘀同治。桂枝茯苓胶囊 (桂枝、茯苓、牡丹皮、芍药、桃仁)具有活血通络，化瘀消癥功效，治疗原则恰合本病病机。文献报道该方的五味生药均有抗炎作用，该药所含的芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚等有效成分可通过抑制前列腺素E2(PGE2)的合成、增强巨噬细胞的吞噬功能、抑制血小板聚集及血栓素的生成、降低纤维蛋白溶酶的活性、增加外周血流量、促进微血流等作用［9］改善微循环状态。本课题组前期实验工作也已证实桂枝茯苓胶囊具有保护血管内皮细胞、改善血管舒缩功能、抑制炎症反应等抗动脉粥样硬化作用［10］。

MMP-2能特异性降解基底膜 (基底膜的降解是平滑肌细胞迁移和增殖的前提之一)，能增加中性粒细胞与内皮细胞的黏附，触发炎性反应，产生的各种致炎因子又能促进MMP-2基因的转录和表达，导致毛细血管遭受进一步破坏。MMP-2还能拮抗某些肽类物质的舒张血管效应，与血栓烷素协同参与缩血管反应，而这些作用进一步加重血管重塑和微小动脉化生，最终导致心肌微小动脉密度增加，毛细血管密度降低［11］，从而使毛细血管血容量下降，冠脉微循环障碍，心肌缺血。

本研究相关分析显示MMP-2表达与心肌微血管病变关系密切，拮抗MMP-2表达可能有助于防止心肌微小血管病变。进一步的药物干预结果显示:模型组大鼠微小动脉密度明显增高，毛细血管密度明显降低，提示模型组出现微小血管病变。而治疗组、西药对照组与模型组相比微小血管病变程度明显改善。桂枝茯苓胶囊治疗组与西药对照组(辛伐他汀联合卡托普利)相比，微小血管病变程度有进一步改善趋势，但差异尚无统计学意义。提示桂枝茯苓胶囊能通过上调MMP-2表达改善冠脉微小血管异常改变。而这种作用可能是通过抑制血管炎症反应、保护血管内皮功能等调节血脂以外的机制。具体发挥作用的有效成分及更深层次的机制尚待进一步研究。

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