酒制瑞香狼毒对荷瘤小鼠抑瘤作用及机制的实验研究

2013-08-28马晓莉刘晋芝曹松云张新颖

中成药 2013年6期

马晓莉，刘晋芝，曹松云，王淼，张新颖

(河北大学中医学院，河北保定 071000)

瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物Stellera chamaejasmeL.的干燥根，其味苦、辛，性平，有毒，入肝、肺、脾三经，有逐水、祛痰、破积、杀虫之功效［1］。瑞香狼毒用于治疗肿瘤在我国已有悠久的历史。诸多文献报道生药狼毒既有明显的体外抗肿瘤作用［2］，又具有非常强的体内抗肿瘤作用［3］，其含药血清也有明显的抗肿瘤作用［4］。但瑞香狼毒全草有毒，特别是对胸腺、脾脏等重要器官毒副作用较大。蒙医在防病、治病的实践中，摸索出狼毒的多种炮制方法，以达到减毒增效的目的，其中酒制狼毒有抗肿瘤作用，但炮制机理研究较少。本文通过H22荷瘤小鼠体内抑瘤实验，考察了酒制对瑞香狼毒抑瘤作用的影响，探讨其抑瘤机制，为瑞香狼毒的进一步开发、应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂狼毒购自安国市昌达中药材饮片有限公司，留300 g作为生药狼毒组的用药;酒制狼毒的制备:另外取300 g狼毒饮片，制备酒制狼毒，加60°白酒 (红星二锅头，北京红星公司产品)没过狼毒，浸泡6 h后，用文火煮至白酒完全被狼毒吸收，60℃烘干。

1.2 实验动物与瘤株实验动物为雄性昆明种小鼠，体质量 (20±2)g，购自河北医科大学实验动物中心，实验动物合格证号1112090。瘤株为H22小鼠腹水型肝癌细胞株，由河北大学基础医学院微生物免疫实验室惠赠。

1.3 动物处理与分组先从80只小鼠中随机取10只不接种肿瘤，作为空白对照组;余下的70只接种肿瘤。取接种6 d肿瘤生长良好的小鼠腹水，用生理盐水稀释成1×106/mL，以每只0.2 mL的量接种于小鼠右侧腋窝皮下，接种后24 h随机分为7组，第一组为肿瘤对照组，其余6组为治疗组，即生药狼毒低、中、高剂量组 (低、中、高剂量分别为5、10、20 g/kg体质量的生药狼毒药液)，酒制狼毒低、中、高剂量组 (低、中、高剂量分别为5、10、20 g/kg体质量的酒制狼毒药液)，空白对照组和肿瘤对照组给20 g/kg体质量的生理盐水。接种24 h后开始灌胃1 mL，每天1次连续8 d。于停药后次日处死小鼠，称体质量解剖皮下瘤块，取脾脏和胸腺，分别再称定质量，计算肿瘤抑制率和脾、胸腺指数。

1.4 指标测定

1.4.1 体质量增长将肿瘤对照组、狼毒生药对照组和酒制狼毒低、中、高剂量各组小鼠在接种肿瘤后24 h称取实验动物体质量，并以苦味酸作标记，末次给药后24 h再次称取体质量并减去瘤质量，两次体质量差即为体质量增长指标。

1.4.2 抑瘤率按1978年全国抗癌药物研究协会制定的《抗肿瘤药物体内筛选规程》判定肿瘤抑制率［5］。将狼毒生药组和酒制狼毒低、中、高剂量各组小鼠末次给药后24 h处死动物，剥离瘤体电子天平称定质量，计算抑瘤率。

1.4.3 脾指数的测定将所有各组小鼠采用称重法将小鼠称定质量后脱颈处死，剥离脾脏，电子天平称定质量，计算脾指数 (mg/g)。

1.4.4 胸腺指数的测定将所有各组小鼠采用称重法将小鼠称定质量后脱颈处死，剥离胸腺，电子天平称定质量，计算脾指数 (mg/g)。

1.4.5 Bax、Bcl-2免疫组织化学染色将生药狼毒组和酒制低、中、高剂量组小鼠脱颈椎处死后很快取出肿瘤，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、透明、包埋成石蜡切片，每张均切4 μm薄的切片，准备做免疫组化。免疫组化步骤:石蜡切片，60℃烤箱烤片20 min后，二甲苯脱蜡、不同浓度酒精脱水，3%H2O2去离子水孵育30 min，以封闭内源性过氧化物酶;0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波修复;自然冷却至室温;分别用兔抗鼠Bax和Bcl-2抗体 (Santa cruz，1∶100)孵育切片 (4℃，过夜);滴加试剂1，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育20 min;滴加试剂2，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育20 min;DAB避光显色1至2 min。每步骤间用0.01 mol/L PBS充分洗涤，再经过石蜡切片的常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍摄照片。对照试验:省去一抗或用PBS代替一抗孵育切片，结果为阴性。

1.5 统计分析

1.5.1 使用医学图像分析仪 (TN-8502)，镜下观察狼毒生药组和酒制狼毒低、中、高剂量各组染色结果，并测定细胞灰度值，用该仪器自带分析软件分析相应抗体的表达量。以上四组每组取五张切片，每张切片选五个视野，计算其平均值即为该张切片的灰度值，五张切片的平均值为该组的灰度值。

2 实验结果

2.1 酒制狼毒各组对抑瘤率的影响生药狼毒对荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用，20 g/kg体质量生药狼毒灌胃抑瘤作用最好，抑瘤率为69.45%，5、10 g/kg生药狼毒抑瘤率为46.78%、52.34%。经过用白酒炮制后狼毒对肿瘤的抑制作用明显增强，酒制狼毒低、中剂量组的抑瘤率分别高达98.40%、87.16%，高剂量酒制狼毒对肿瘤的抑制和生药狼毒比有所下降，抑瘤率为50.21%。见表1。

表1 生药狼毒和各组酒制狼毒对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响(±s，n=10)Tab.1 Effect of tumor inhibition of liquor-saturated Stellera chamaejasme and crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

注:与肿瘤对照组比较，▲P＜0.05;与生药狼毒高剂量组比较，■P＜0.05。

组别瘤质量/g 抑瘤率/%肿瘤对照组0.655 6±0.416 9 －生药狼毒低剂量组 0.545 0±0.396 6▲ 46.78生药狼毒中剂量组 0.418 9±0.527 8▲ 52.34生药狼毒高剂量组 0.200 3±0.176 4▲ 69.45酒制狼毒低剂量组 0.010 5±0.011 2▲■ 98.40酒制狼毒中剂量组 0.084 2±0.101 4▲■ 87.16酒制狼毒高剂量组 0.326 4±0.366 2▲50.21

2.2 酒制狼毒各组对体质量增长、脾脏和胸腺的影响与空白对照组比较，生药狼毒组和酒制狼毒低、中、高剂量组的体质量增长均P＞0.05，无明显变化;与空白对照组比较，酒制狼毒低、中、高剂量各组对脾脏、胸腺的毒副作用小，脾指数、胸腺指数均P＞0.05;生药狼毒组对脾脏、胸腺影响较大，与空白对照组比较脾指数、胸腺指数均P＜0.05;与生药狼毒组比较，酒制狼毒低、中、高剂量各组的脾指数和胸腺指数均P＜0.05。见表2。

2.3 生药狼毒和各组酒制狼毒对Bax及Bcl-2表达的影响与生药狼毒组比较，酒制狼毒各组明显使Bax表达上调，Bcl-2的表达下调，P＜0.05有统计学意义。见表3。

表2 生药狼毒和各组酒制狼毒对H22荷瘤小鼠体质量增长、脾指数、胸腺指数的影响 (±s，n=10)Tab.2 Effect of body weight，thymus index，spleen index in liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

注:与空白对照组比较，■P＜0.05，与生药狼毒组比较，▲P＜0.05。

脾指数胸腺指数空白对照组组别体质量增长值/g 3.970 0±1.314 9 0.452 6±0.116 9 0.257 4±0.072 5肿瘤对照组 3.554 4±2.158 1 0.403 0±0.107 4 0.228 3±0.059 1生药狼毒组 4.259 6±2.120 3 0.213 4±0.150 9■ 0.109 3±0.084 7■酒制狼毒低剂量组 4.269 4±2.058 4 0.482 0±0.103 6▲ 0.279 6±0.435 0▲酒制狼毒中剂量组 4.705 8±1.178 4 0.475 6±0.151 0▲ 0.264 5±0.055 8▲酒制狼毒高剂量组 2.929 1±0.993 3 0.413 6±0.117 4▲ 0.253 8±0.070 5▲

表3 Bax、Bcl-2在各组酒制法狼毒和生药狼毒组中表达的比较 (±s)Tab.3 Comparison of Bax and Bcl-2 on liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme(±s)

注:与生药狼毒组比较，■P＜0.05;与肿瘤对照组比较，▲P＜0.05。

组别测量视野数Bax Bcl-2生药狼毒组 25 10.31±2.26▲ 31.24±2.58▲肿瘤对照组 25 6.23±2.18 42.38±1.86酒制狼毒低剂量组 25 28.69±2.63■▲ 12.13±2.32■▲酒制狼毒中剂量组 25 26.75±1.78■▲ 17.36±1.92■▲酒制狼毒高剂量组 25 22.31±3.27■▲ 20.45±2.76■▲

取生药狼毒组和酒制狼毒低、中、高剂量组的肿瘤，做免疫组化常规DAB显色，Bax表达阳性的为细胞质有棕黄色颗粒，与肿瘤对照组比较，生药狼毒和酒制狼毒棕黄色颗粒都有增加;与生药狼毒组比较，酒制毒低、中剂量棕黄色颗粒增加较多，高剂量增加较少 (见图1)。

取生药狼毒组和酒制狼毒低、中、高剂量组的肿瘤，做免疫组化常规DAB显色，Bcl-2表达阳性的为细胞质有棕黄色颗粒，与肿瘤对照组比较，生药狼毒组和酒制狼毒棕黄色颗粒减少;与生药狼毒组比较，酒制狼毒低、中剂量棕黄色颗粒明显减少，高剂量亦减少，与低、中剂量比稍高 (见图2)。

3 讨论

因昆明种小鼠和裸鼠的荷瘤率均为100%，本实验目的是研究酒制狼毒抗肿瘤的作用及对胸腺、脾脏等重要脏器的影响，所以荷瘤小鼠选的是昆明种小鼠而非裸鼠。

图1 生药狼毒和各组酒制狼毒及肿瘤对照组Bax的表达 (DAB×400)Fig.1 Comparison of the expression of Bax among crude Stellera chamaejasme，groups of liquorsaturated Stellera chamaejasme and tumor contrast(DAB×400)

图2 生药狼毒和各组酒制狼毒及肿瘤对照组Bcl-2的表达 (DAB×400)Fig.2 Comparsion of the expression of Bcl-2 among groups of crude Stellera chamaejasme，liquorsaturated Stellera chamaejasme and tumor contrast(DAB×400)

中药狼毒在中国被广泛应用于治疗肿瘤，其中有多种成分被发现有抗肿瘤的功能［6］。本实验通过动物实验证实生药狼毒的抗肿瘤作用明显。在表1中可以看到生药狼毒的最大抑瘤率达到69.45%。炮制后，低、中剂量酒制狼毒抑瘤率大幅提高，尤其低剂量酒制狼毒的抑瘤率高达98.40%，中剂量酒制狼毒也达到87.16%，比同剂量生药狼毒的抑瘤率增加，这说明用白酒炮制后能显著提高生药狼毒的疗效。狼毒又名断肠草［7］，对身体的危害较大，用白酒炮制后低剂量就能达到很好的抑瘤作用，这样就可以减少狼毒的用量，从而能减轻狼毒对身体的伤害。至于高剂量酒制狼毒比生药狼毒的抑瘤率降低，需进一步做实验探讨其机理。

经白酒炮制后既提高了狼毒的疗效亦能降低其对脾脏和胸腺的损害，从表2中可以看到，与正常对照组比较，酒制低、中、高剂量组的脾指数和胸腺指数P＞0.05，说明没有差异，经白酒炮制后狼毒的毒性明显降低，对脾、胸腺没有明显损害。与正常对照组比较，生药狼毒的脾指数和胸腺指数均P＜0.05，说明有显著性差异，生药狼毒对脾和胸腺的损伤较大。从表2数据可以得出，与生药狼毒组比较，酒制低、中、高剂量各组的脾指数和胸腺指数均P＜0.05，说明经白酒炮制后确实减轻了狼毒的毒性，明显降低了对这些免疫脏器的损伤。经白酒炮制后用较低剂量的狼毒就能达到很理想的抑瘤作用，对脾、胸腺等重要器官又没有明显的毒副作用，为狼毒用于临床抗肿瘤提供新的思路。

酒制狼毒与生药狼毒比较能显著提高抑瘤率，其作用机制可能是使Bax的表达明显上调，Bcl-2的表达逐渐下调。抗凋亡基因编码的Bcl-2蛋白主要分布在线粒体外膜、细胞膜内表面、内质网膜及核膜等处［8］。它广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种肿瘤细胞，体内和体外实验都表明Bcl-2基因可抑制各种刺激下多种细胞的凋亡［9］。Bcl-2抗凋亡的机制目前认为主要有:①拮抗促凋亡基因bax;②抑制促凋亡的蛋白质细胞色素c自线粒体释放到胞质;③ 阻止胞质中的细胞色素c激活caspase;④有抗氧化及维持细胞内钙稳态等作用［10］。Bax基因属于Bcl-2基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，Bax是极重要的促细胞凋亡基因之一［11］。Bcl-2基因启动子具有NF-κB的结合位点并受其调控，故NF-κB可活化通过诱导Bcl-2及其他抗凋亡基因而阻止细胞凋亡。也可通过刺激IL-1β转化蛋白酶、c-myc和TNF-α基因表达而导致细胞凋亡［12］。

本研究结果显示，与肿瘤对照组比较，生药狼毒组和各组酒制狼毒小鼠肿瘤细胞Bax蛋白表达量高，Bcl-2蛋白表达降低，从而促进了肿瘤细胞凋亡，这与前面生药狼毒和各组酒制狼毒均有明显的抑瘤作用一致;与生药狼毒组比较，酒制狼毒低、中、高剂量各组小鼠肿瘤细胞Bax蛋白表达量高，Bcl-2蛋白有表达降低。表明酒制狼毒比生药狼毒抑瘤作用提高可能是通过调控Bax和Bcl-2的表达，促进了肿瘤细胞的凋亡。

本实验结果显示，生药狼毒经白酒炮制后既大大提高了抑瘤作用，又显著降低了对胸腺、脾脏的毒副作用，临床可考虑用酒制狼毒代替生药狼毒入药，但其药效物质基础需进一步研究。

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