四逆汤制备工艺参数优化

李 莹， 张慧敏， 何 瑶， 闫 莉， 傅超美

(成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川成都611137)

四逆汤方出自《伤寒论》，由附子、甘草(炙)、干姜组成，是温肾健脾、回阳固本的经典名方［1-2］。现代研究表明［3-7］，本方对动物脑缺血、休克、脑梗死、心肌梗死等症候均具有良好的治疗效果。汤剂是传统中医最有效及最常用的剂型之一，科学合理的制备工艺是保证四逆汤质量和疗效的关键，但目前对四逆汤汤液制备工艺的研究［2，8］尚少，且尚未见对其从化学成分和药理作用多角度的综合分析。本课题前期研究［9］表明从化学成分角度分析，四逆汤的传统煎煮法与《中国药典》(2010年版一部)［1］所载方法相比具一定优势，故本实验综合化学指标和药效指标对传统煎煮工艺参数进行优化。

本实验基于人工神经网络模型模拟的良好特性，在正交设计所得化学和药效两方面数据基础上，利用BP网络优化工艺参数，以期得到比正交设计更合理的四逆汤制备工艺，以确保所制备四逆汤的有效性，为本课题的进一步研究奠定基础。

1 仪器与材料

Agilent 1200型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司);METTLER AE240电子分析天平 (十万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司);202-2型干燥箱 (上海市实验仪器总厂)。

昆明种清洁级健康小鼠100只，雌雄各半，体质量 (20±2)g(由四川省医学科学院实验动物研究所提供，实验动物生产许可证编号:SCXK(川)2008-24)。

甘草酸单铵、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等对照品购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均≥98%，批号依次为A0039、MUST-11050502、MUST-11050501、MUST-11050503(供定量测定用);甲醇、乙腈为色谱纯(美国Sigma-Aldrich公司);水为超纯水;其余试剂均为分析纯。生附片 (批号:1202015)购自四川新荷花中药饮片有限公司，炙甘草 (批号:120408)和干姜 (批号:120205)均购自四川科伦天然药业有限公司，经成都中医药大学卢先明教授鉴定，均符合2010年版《中国药典》相关标准。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 单酯型生物碱 Symmetry Shield RP18色谱柱 (Waters公司，4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相A为5 mmol/L醋酸铵溶液 (含0.1%醋酸)，流动相B为乙腈 (含0.1%甲酸)，采用梯度洗脱，梯度程序为0～15 min:25% ～40%B，15～30 min:40%～45%B;检测波长235 nm;体积流量1 mL/min，进样量10 μL;理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算不低于3×103。

2.1.2 甘草酸 色谱条件及方法学考察 均按文献甘草酸测定［9］的相关内容进行。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 单酯型生物碱 分别取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加二氯甲烷-异丙醇(1∶1)混合溶液溶解并定容，配成单酯型生物碱对照品贮备液，其中含苯甲酰新乌头原碱87.2 μg/mL、苯甲酰乌头原碱7.0 μg/mL、苯甲酰次乌头原碱 23.0 μg/mL。

2.2.2 甘草酸 取甘草酸单铵对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相［甲醇－0.2 mol/L醋酸铵溶液 (含0.5%冰醋酸)65∶35］溶解并稀释至刻度，配置成含甘草酸单铵2.164 mg/mL(即折合甘草酸2.120 mg/mL)的对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 测定单酯型生物碱样品 称取生附片150 g、炙甘草饮片150 g和干姜饮片100 g，置圆底烧瓶中，按2.7项下正交设计的不同工艺参数制备9组四逆汤溶液，浓缩至200 mL。分别精密吸取5 mL，以10 000 r/min离心15 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3.2 测定甘草酸样品 同文献甘草酸测定［6］的相关内容进行。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰乌头原碱对照品贮备液0.5、2、4、6、8、10 mL，苯甲酰次乌头原碱对照品贮备液0.5、2、4、6、8、15于25 mL量瓶中，分别加二氯甲烷-异丙醇 (1∶1)混合溶液稀释至刻度，配成不同浓度对照品溶液，进样10 μL，在单酯型生物碱色谱分析条件下测定。分别以进样质量浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积 (A)为纵坐标绘制标准曲线，单酯型生物碱的回归方程、r值及线性范围见表1。

表1 3种单酯型生物碱线性关系Tab.1 Linear relations test results of the monoester-alkaloids

2.4.2 精密度试验 分别取单酯型生物碱、甘草酸单铵对照品稀释液，分别重复进样6次，进样量10 μL，依各法测定，记录峰面积，结果测得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和甘草酸的 RSD分别为0.93%、1.34%、0.65%和0.76%。结果表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 按正交设计方法制备的9号样品溶液制备方法，平行制备5份供试品溶液，进样量10 μL，依各法测定，记录峰面积。结果计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和甘草酸的RSD分别为1.05%、1.52%、0.87%和1.02%，结果表明各方法重复性均良好。

2.4.4 稳定性试验 取按正交设计方法制备的9号样品溶液方法制备的供试品溶液，4℃下放置0、2、4、6、8、10 h，进样量 10 μL，依各法测定，记录峰面积。结果计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和甘草酸的RSD分别为0.42%、0.78%、0.55%和0.97%。结果表明样品溶液在配制后10 h内均稳定。

2.4.5 加样回收率试验 分别称取6份生附片7.5 g、炙甘草饮片7.5 g和干姜饮片5 g，分成3组，按已知量 (苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和甘草酸质量浓度分别为15.61、2.07、5.40、8.172 mg/mL)分别加入相当于0.8、1.0、1.2倍量苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和甘草酸单铵对照品溶液，按正交9号供试品的方法制备，依各法测定，计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和甘草酸的平均回收率分别为102.63%、95.92%、96.25%和99.46%，RSD分别为1.83%、2.05%、1.37%和1.26%。

2.5 样品定量测定

分别按正交设计按不同工艺参数制备的9组四逆汤溶液，进样量10 μL，依各法测定，记录峰面积，计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和甘草酸的量，同时考察正交设计各组制备的四逆汤对小鼠抗脑缺氧能力的影响，并设灌胃生理盐水的空白对照组。结果见表2。

表2 L9(34)正交试验设计及结果(±s，n=10)Tab.2 Design and results of L9(34)orthogonal test(±s，n=10)

表2 L9(34)正交试验设计及结果(±s，n=10)Tab.2 Design and results of L9(34)orthogonal test(±s，n=10)

注:与空白对照组 ［喘气次数:(11.54±2.33)次，喘息时间:(18.28±2.93)min］比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

序号 A B/h C/次 空列 单酯型生物碱Y1/(μg·mL－1)7.5 3.112 15.13 12.1±2.80 20.69±2.41 2 1(1 ∶6) 2(1.5) 2(2) 2 11.91 4.386 19.56 15.0 ±2.15＊＊ 24.49 ±3.36＊＊3 1(1∶6) 3(2) 3(3) 3 16.25 7.910 24.61 12.9±2.72* 22.80±3.10＊＊4 2(1 ∶8) 1(1) 2(2) 3 14.96 4.490 20.27 15.7 ±2.11＊＊ 24.44 ±1.28＊＊5 2(1 ∶8) 2(1.5) 3(3) 1 25.61 8.278 28.40 14.5 ±3.47＊＊ 22.71 ±3.65＊＊6 2(1 ∶8) 3(2) 1(1) 2 9.66 3.748 17.17 14.9 ±1.28＊＊ 23.20 ±3.50＊＊7 3(1∶10) 1(1) 3(3) 2 21.56 8.564 26.43 13.9±2.64* 21.48±2.27*8 3(1∶10) 2(1.5) 1(1) 3 10.67 4.266 17.59 14.1±2.77* 22.45±2.18＊＊9 3(1∶10) 3(2) 2(2) 1 21.01 8.172 22.63 13.4±2.10* 21.26±3.89*K1 158.39 181.53 121.75 218.62化学 K2 198.72 195.29 193.88 181.78指标 K3 221.78 202.07 263.26 178.49 R 21.13 6.85 47.17 13.38 K1 266.18 268.80 266.34 259.40药效 K2 287.26 281.05 283.75 280.71指标 K3 264.94 268.53 268.29 278.27/min 1 1(1∶6) 1(1) 1(1)1甘草酸Y2/(mg·mL－1)干膏率Y3/%喘气次数Y4/次喘息时间Y5 7.44 4.17 5.80 7.10 R

2.6 四逆汤对小鼠抗脑缺氧能力的影响［10-11］

将小鼠随机分为10组，不同工艺制备的四逆汤9组，空白对照1组，每组10只，雌雄各半，试验前禁食12 h，自由饮水。分别单剂量 (0.3 mL/20 g)灌胃四逆汤溶液 (空白对照组灌胃生理盐水)。连续给药3 d，于末次给药40 min后，用大剪刀在小鼠耳后2 mm处快速断头，立即观察并记录小鼠脑死亡前张口喘气次数及喘息时间。经统计，与空白对照组比较，正交设计各组除第1组以外，均具有显著性差异 (P＜0.05或P＜0.01)，表明正交设计各组所制备四逆汤 (第1组除外)均对小鼠急性脑缺氧具有明显的保护作用，见表2。

2.7 正交试验方法与结果

根据预试验结果，选择以料液比 (A)、提取时间 (B)、提取次数 (C)为考察因素，以单酯型生物碱 (即苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)的质量浓度之和、甘草酸的质量浓度及干膏收率为化学指标Ya(加权综合评分:Ya%=Y1/Y1，Max×60+Y2/Y2，Max× 30+Y3/Y3，Max×10，其中Y1为每个试验号样品重复取样3次测得单酯型生物碱质量浓度和的平均值，Y1，Max为9个样品中单酯型生物碱质量浓度和平均值中的最大值，Y2是每个试验号样品重复取样3次测得的甘草酸质量浓度平均值，Y2，Max为9个样品中甘草酸质量浓度的最大值，Y3为每个样品的干膏收率，Y3，Max为9个样品中干膏收率的最大值)，以喘气次数和喘息时间为药效指标Yb(加权综合评分:Yb%=Y4/Y4，Max× 50+Y5/Y5，Max× 50，其中Y4为每个试验号样品组10只小鼠的平均喘气次数，Y4，Max为9个样品组中小鼠喘气次数的最大值，Y5为每个试验号样品组10只小鼠的平均喘息时间，Y5，Max为9个样品组中小鼠喘息时间的最大值)进行L9(34)正交试验优选最佳工艺条件，正交设计因素水平见表2。

以化学指标 (单酯型生物碱的量、甘草酸的量和干膏收率)和药效指标 (喘气次数与喘息时间)为指标，选用正交试验设计进行试验，结果见表2。由极差分析结果可知，各因素对化学指标影响的重要性依次为 C＞A＞B;各因素对药效指标的影响的重要性依次为 A＞C＞B。由正交设计的极差分析结果得到的最佳制备工艺为A2B2C2或A3B3C3。

2.8 基于正交设计的人工神经网络优化［12-14］

通过正交设计优化的制备工艺参数有两组，为优选出最佳的工艺参数，以正交试验数据为训练样本，建立人工神经网络 (ANN)，并训练该网络，再使用该网络预测 (优化)工艺参数。

以正交试验中每组试验3个因素的数值作为输入，以综合评分 (化学指标与药效指标之和:Y%=Ya%+Yb%)作为输出，运用 MATLAB(R2010b版本，Math Works，美国)软件编程，建立前馈人工神经网络 (BPNN)。网络设置一个隐含层，含20个神经元，采用 Levenberg-Marquardt算法，最大迭代次数为100次，网络计算精度取0.000 1，建立并训练网络，很快的得到满足要求的BP神经网络。然后依次对3个因素定一个合适的步长，并用3个循环对每个因素定义域的值进行编程，以寻找使输出值 (综合评分)最大的组合。人工神经网络模型运行的结果是料液比为1∶8，提取3次，每次1.5 h。

2.9 验证试验

称取生附片150 g、炙甘草饮片150 g和干姜饮片100 g，分别按正交设计试验和ANN优选的最佳制备工艺参数、《中国药典》2010年版一部［1］所载方法分别平行安排试验，制备四逆汤，依各法分别测定，结果见表3。

表3 验证试验结果(±s，n=5)Tab.3 Verifying test results(±s，n=5)

表3 验证试验结果(±s，n=5)Tab.3 Verifying test results(±s，n=5)

注:与人工神经网络优化组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

参数水平 单酯型生物碱 甘草酸 干膏率 喘气次数 喘息时间料液比组别 提取时间/h提取次数/次质量浓度/(μg·mL－1)RSD/%质量浓度/(μg·mL－1)RSD/% 得率/% RSD/%次数/次RSD/%常态/min RSD/%8.60 1∶10 2 3 24.91±0.19＊＊ 0.76 8.26±0.16 1.95 28.21±0.18 0.65 12.7±1.89＊＊ 14.87 21.00±1.90* 9.06 ANN优化 1∶8 1.5 3 25.35±0.34 1.35 8.51±0.20 2.31 28.07±0.36 1.28 15.8±1.48 9.34 23.82±0.97 4.08《中国药典》方法 2，1.5 2 17.82±0.40＊＊ 2.26 2.52±0.18＊＊ 2.38 6.21±0.15＊＊ 2.41 12.7±1.77＊＊ 13.91 21.39±2.50*正交优化 1∶8 1.5 2 21.55± 0.53＊＊ 2.44 7.14±0.13＊＊ 1.83 23.02±0.19＊＊ 0.83 14.3±1.64＊＊ 11.44 22.38±1.93*12.89

结果显示，按ANN优化的参数试验的考察指 标均处于较高水平，且重复性良好;将各组结果分别与ANN优化的结果进行t检验 (双侧)，除正交优化结果 (A3B3C3)的甘草酸与干膏率外，其它各组与ANN优化的结果均具有显著性差异 (P＜0.05或P＜0.01)，表明ANN优选的工艺比正交试验所得工艺更优越且稳定合理，具有可操作性。

3 讨论

目前研究认为四逆汤方中的君药—附子的有效成分为酯型生物碱成分，《中国药典》2010年版［1］一部附子“含量测定”项对单酯型生物碱 (苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱)的含量进行了相关规定;《中国药典》中四逆汤的“含量测定”项对甘草酸的含量进行了相关规定，故本实验选择单酯型生物碱和甘草酸的含量作为四逆汤有效成分的考察指标。同时，本研究还采用RP-HPLC对正交各组样品所含双酯型生物碱(新乌头碱、乌头碱和次乌头碱)的量进行了测定，结果均符合《中国药典》的限量规定。试验各组制备四逆汤均符合《中国药典》的相关规定，且通过联用ANN与正交试验得到比正交试验优化的工艺更合理的工艺参数。

分别以化学指标和药效指标的正交设计试验结果进行方差分析，结果显示各因素均不具显著性(P＞0.05)，故正交设计试验的结果仅采用极差分析结果进行试验参数的优选。正交试验各组 (除第1组外)药效与空白对照组进行数据分析均具有显著性差异，正交试验方差分析只有因素A(料液比)和 C(提取次数)具一般显著性 (P＜0.1)，分析四逆汤对小鼠急性脑缺氧的保护作用与制备工艺参数只有一般显著性影响，另药效试验部分均属重复取样，正交分析结果也有所差异。

现代研究显示，四逆汤对脑细胞和心肌细胞缺氧具有较好的改善效果［2-4］。本研究以小鼠全脑缺血-再灌注损伤模型为代表，将小鼠抗急性脑缺氧能力的提高作为四逆汤药理作用的体现，以保证该制备工艺研究下四逆汤的临床疗效。该药理模型下，小鼠断头后，脑供血中断，脑内残余的血和营养物质可以使脑功能维持一定时间，其表现为离体鼠头有规律的张口喘息，故以喘气时间和喘气次数反映小鼠抗急性脑缺氧能力。结果表明四逆汤正交试验各组 (第1组除外)对小鼠的急性脑缺氧有明显的保护作用。

当实验有多因素多指标时，通过选择正交设计、均匀设计、星点设计等其中的一种试验设计优选出的工艺参数，常需要大量而反复的工作，优选出来的参数往往是较优的而非最佳的。本实验正交试验对制备四逆汤的多指标多因素进行考察，联用人工神经网络则恰好地发挥其以最大的精度逼近非线性函数模型的优势，最终获得最符合的实验要求的优化参数。

为了减少训练中的计算量和内存需求量，本实验采用了 Levenberg-Marquardt算法［13］(trainlm)建立神经网络，因为该函数很好的利用了MATLAB中对于矩阵的运算的优势，对于中等规模的BP神经网络具有最快的收敛速度。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］北京:中国医药科技出版社，2010:650.

［2］吴伟康.四逆汤现代研究与应用［M］北京:人民卫生出版社，2011:117.

［3］商李超，郁保生.四逆汤的药理作用研究进展［J］.中西医结合脑血管病杂志，2009，7(11):1333-1335.

［4］姜之全，陈前芬，田鹤村.四逆汤对小鼠全脑缺血-再灌注损伤的保护作用［J］.中国脑血管病杂志，2004，1(12):556-558.

［5］Chen H C，Chen W C，Lin K H，et al.Simultaneous use of traditional Chinese medicine(si-ni-tang)to treat septic shock patients:study protocol for a randomized controlled trial［J］.Trials，2011，12:199.

［6］党万太，苗维纳，杨晓放，等.去磷酸化NFATc蛋白的相对表达与四逆汤治疗心力衰竭的机制分析［J］.中药药理与临床，2011，27(4):1-3.

［7］廖火城，刘 勇，周 彬，等.四逆汤对异丙肾上腺素引起的大鼠心肌纤维化和TGF-β1表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2010，26(7)，1316-1320.

［8］凌家俊，周莉玲.四逆汤提取工艺的筛选［J］.广州中医药大学学报，2000，17(2):167-170.

［9］李 莹，章津铭，傅超美，等.不同方法制备四逆汤中化学成分对比研究［J］.中成药，2012，34(4):673-677.

［10］高允生，齐永秀，李 珂.白花丹参茎叶水提物对小鼠缺氧模型的保护作用［J］.中国中医药科技，2006，13(3):171-172.

［11］颜景峰，李金平，寇俊萍，等.鲁斯可皂苷元对小鼠脑缺血缺氧的保护作用［J］.中药新药与临床药理，2010，21(4):331-334.

［12］刘海臣，卓金武，吴国光.基于人工神经网络的茶叶咖啡因提取条件的优化［J］.应用化学，2007，24(4):457-460.

［13］魏国栋，李夏兰，王昭晶，等.均匀设计法优化芥菜多糖的提取工艺及其神经网络模型的研究［J］.食品与发酵工业，2006，32(2):53-56.

［14］闻 新，周 露，李 翔，等.MATLAB神经网络仿真与应用［M］.北京:科学出版社，2003.