HIV-1 gp120真核表达载体的构建及表达

陈文江

自1981年确认第1例艾滋病以来，发病率急剧上升，目前全球大约有6000万人感染HIV，其中死亡2000多万。研究表明，天然的HIV-1包膜蛋白以三聚体的形式存在于病毒颗粒和感染细胞的表面［1］，所以，获得模拟天然构象的抗原蛋白对于改善包膜的免疫原性，研究包膜糖蛋白的生物学特性，为研制有效的HIV-1包膜疫苗、研究包膜糖蛋白的结构及功能提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料 质粒pBluescript SKII：原核表达载体，购自上海生工生物技术有限公司；质粒pcT-MTQ(由哈医大病原课题组构建)：含有CMV启动子、tPA信号肽和蛋白质三聚化模序MTQ的质粒；HIV-1原代分离株06044：R5亲嗜性，分离自黑龙江省 HIV-1感染者；宿主菌：大肠杆菌 JM109；HEK293T 细胞(ADCC No．CRL-11268)；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(日本 TaKaRa)；限制性内切酶 EcoR I、Nhe I、Xho I(日本TaKaRa)；T4连接酶(美国 Invitrogen)；DL2000 DNA Marker(日本 TaKaRa)；ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit(美国Zymo Research)；PCR引物(上海生工生物技术生物公司)；

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 06044株gp120真核表达载体的构建

1.2.1.1 构建策略 首先按照真核细胞基因偏嗜性进行包膜基因密码子优化。PCR扩增包膜gp120基因，PCR产物上下游分别引入EcoR I和Xho I位点，克隆至pcT-MTQ载体的EcoR I和Xho I位点之间，删除MTQ模序，构建gp120单体蛋白表达载体 pcT．06044 gp120 m/co(简称 gp120 m)；PCR扩增gp120基因，PCR产物上下游分别引入EcoR I和Nhe I位点，克隆至 pcT-MTQ载体 MTQ模序基因的上游，构建gp120三聚体蛋白表达载体 pcT．06044 gp120T/co(简称gp120T)。

1.2.1.2 构建过程 先对包膜基因密码子进行修饰，调整env基因序列的GC含量至55.56%，并合成至pBluescript SKII载体上。PCR扩增不含信号肽的 gp120基因，根据06044 env序列，设计引物。PCR产物的纯化后，将PCR产物和载体pcT-MTQ双酶切，回收目的基因和线性载体。酶切产物连接，利用T4连接酶，将含有相同粘性末端的基因片段pcT-MTQ和gp120连接在一起，使其形成重组的闭合环状质粒DNA。重组质粒转化大肠杆菌后，对阳性克隆进行筛选及鉴定，提取疑似阳性克隆的质粒DNA，通过双酶切的方法验证构建是否成功，选取3个酶切鉴定正确的克隆送至北京Invotrogen公司进行核酸序列测定。测序结果用GeneRunner3.05软件进行分析。

1.2.2 HIV-1 gp120包膜蛋白在293T细胞中的表达及初步鉴定

1.2.2.1 重组质粒转染293T细胞 利用Lipofectamine2000将gp120蛋白表达载体gp120T或gp120 m转染至293T细胞，使重组gp120蛋白在293T细胞中瞬时表达。转染实验操作参照Lipofectamine2000的说明书进行。

1.2.2.2 表达产物的检测 a)样品处理：转染72 h后，向收获的培养上清或细胞裂解产物中加入1/5体积的6×SDS Buffer，100℃煮沸10 min后，12000 ×g离心10 min，离心收获上清用于SDS-PAGE检测单体形式的gp120蛋白；向收获的培养上清中加入1/5体积的6×Native Buffer，100℃煮沸30s后，8000×g离心5 min，离心收获上清用于检测三聚体形式的gp120蛋白。b)Western blot：配制分离胶和积层胶，上样量20μL/孔；电泳条件为80V 30 min，160V 1.5 h。电泳结束后，将凝胶、PVDF膜、Whatman 3 mm滤纸制成转膜“三明治”，置于半干转转膜仪中，10V转印，单体蛋白转印2.5 h，三聚体蛋白转印4 h；转印后将PVDF膜置于封闭液中，4℃过夜孵育；膜浸入1：1000稀释的Rabbit anti-gp120抗体中，37℃孵育1 h；TBST溶液洗涤3遍后，将膜浸入1：4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗中，37℃孵育1 h；TBST溶液洗涤3遍后，TBS洗涤1遍，然后向膜上滴加化学发光底物，用LAS4000检测发光信号。

1.2.2.3 Western blot结果分析 利用LAS4000 Image Analyzer软件扫描并计算各个特异性gp120条带(AU)和相应背景(BG)的灰度值，每条条带的实际灰度值Gx=AU-BG，以各种形式gp120蛋白的总量Gt作为100%，每种形式gp120的百分数=(Gx/Gt)×100%。

2 结果

2.1 HIV-1 06044 gp120真核表达载体的构建

2.1.1 06044 gp120基因的扩增 用特异引物扩增获得gp120 PCR产物，将其在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后，紫外灯下观察到约1.5 kb的条带，结果与预期片段大小基本相符。

2.1.2 阳性克隆双酶切鉴定结果 重组质粒gp120 m经EcoR I和Xho I双酶切鉴定，获得大小约为5.5kb和1.5kb的两个片段，即分别为pcT-MTQ和gp120目的基因的酶切产物，与预期结果一致；重组质粒gp120T经EcoR I和Nhe I双酶切鉴定，获得大小约为5.6kb和1.5kb的两个片段，即分别为pcT-MTQ和gp120目的基因片段的酶切产物，与预期结果一致。

2.2 06044 gp120蛋白瞬时表达结果

2.2.1 变性SDS-PAGE检测gp120蛋白表达 重组质粒转染293T细胞72 h后，收获培养上清和细胞沉淀，以8%SDSPAGE电泳分析蛋白表达情况。在变性条件下(1% β-ME，1.7%SDS)，单体gp120蛋白表达载体gp120 m和三聚体表达载体gp120T转染后细胞上清中均检测到特异性信号，蛋白大小约120KD，与预期相符。

2.2.2 非还原PAGE检测gp120三聚体蛋白表达 在非还原条件下，其中gp120 m转染组检测到约120KD gp120蛋白，即gp120以单体形式存在；gp120T转染组检测到三种形式gp120蛋白，即单体、二聚体和三聚体。

2.2.3 gp120T转染组不同形式gp120蛋白比例分布 利用LAS4000化学发光检测系统，扫描并计算，得到单体、二聚体和三聚体gp120蛋白的百分比分别为10%、14%和76%。

3 讨论

HIV-1包膜糖蛋白是病毒感染靶细胞的主要媒介，同时是病毒感染后机体抗病毒免疫的主要靶点，因此，体外表达包膜糖蛋白对于研究包膜的结构和功能，揭示病毒侵入靶细胞的机制，以及开发有效的预防性包膜疫苗具有重要意义。但是由于病毒的包膜基因具有病毒密码子偏嗜性［2］，其序列中富含AT碱基，致使包膜蛋白在体外哺乳细胞中难以获得高效表达。针对上述技术难题，本研究采取了相应的应对策略。首先根据哺乳细胞基因密码子使用原则，人工合成包膜基因序列，解决了病毒基因偏嗜性的问题。

天然情况下，包膜糖蛋白以三聚体的形式存在于病毒表面，这种三聚体构象是包膜发挥生物学功能的结构基础。而HIV-1疫苗的早期研究也表明，可溶性的包膜糖蛋白gp120单体疫苗刺激产生的抗体能够很强地与失去天然构象的gp120上的表位作用，但并不能中和原代病毒分离株［3］。因此如何构建可溶的维持寡聚化和天然构象的包膜蛋白，模拟包膜的三聚体结构是研究包膜功能和发展包膜疫苗的先决条件［4］。为了维持蛋白的三聚化构象，向包膜蛋白的C末端引入蛋白质三聚化模序。结合以上三个策略，本研究成功构建了包膜gp120蛋白表达载体，并获得单体和高比例三聚体gp120蛋白的表达［5］，在gp120三聚体表达载体中单体、二聚体和三聚体gp120蛋白的百分比分别为10%、14%和76%，为后续研究蛋白的结构和功能，以及研制包膜疫苗奠定了物质与实验基础。

［1］ Liu Y，Xu Y，Lou Z，Zhu J，Hu X，Gao GF，Qiu B，Rao Z，Tien P．Structural characterization of mumps virus fusion protein core．Biochem Biophys Res Commun，2006，348(3)：916-922.

［2］ Stephens CR，Waelbroeck H．Codon bias and mutability in HIV sequences．J Mol Evol，1999，48(4)：390-397.

［3］ Ledgerwood JE，Graham BS．DNA vaccines：a safe and efficient platform technology for responding to emerging infectious diseases．Hum Vaccin，2009，5(9)：623-626.

［4］ Binley JM，Wrin T，Korber B，Zwick MB，Wang M，Chappey C，Stiegler G，Kunert R，Zolla-Pazner S，Katinger H，Petropoulos CJ，Burton DR．Comprehensive cross-clade neutralization analysis of a panel of anti-human immunodeficiency virus type 1 monoclonal antibodies．J Virol，2004，78(23)：13232-13252.

［5］ Wang S，Farfan-Arribas DJ，Shen S，Chou TH，Hirsch A，He F，Lu S．Relative contributions of codon usage，promoter efficiency and leader sequence to the antigen expression and immunogenicity of HIV-1 Env DNA vaccine．Vaccine，2006，24(21)：4531-4540.