2例类孟买血型的分子机制研究及家系调查

黄丹丹(宁波市中心血站，浙江 宁波 315040)

H抗原是红细胞上的A和B抗原的前体。ABO基因决定A和B抗原，而α-1，2岩藻糖基转移酶基因FUT1(或H)和分泌基因FUT2(或Se)决定H抗原的表达。FUT1基因决定H抗原在红细胞上的表达，FUT2基因决定H抗原在分泌腺和消化液中的表达。类孟买血型在ABO血型系统中为罕见的稀有血型，典型特征为H抗原部分或完全缺失，分泌液中存在H物质。我们发现了2例类孟买型，对其进行了血清学和分子遗传学检测。

1 材料与方法

1.1 对象 先证者1为男性，64岁，浙江汉族，因“肝炎肝硬化失代偿期”被宁波市第二医院收治。入院检查发现患者ABO血型正反定型不符，故来宁波市中心血站协助进一步鉴定。先证者2为男性，60岁，浙江汉族，因术前检查发现ABO血型正反定型不符而送至宁波市中心血站协助进一步鉴定。

1.2 家系调查 在征得先证者及家人同意后，采集其外周血血样，进行相关检测。

1.3 血型血清学实验 ABO正反定型、直接抗球蛋白试验、吸收放散试验、唾液中ABH血型物质测定试验、Lewis血型鉴定按照相关试剂说明书及文献［1］进行。抗-A、抗-B、抗-H、ABO标准红细胞、直接抗球蛋白试剂盒由上海血液生物医药有限责任公司提供，抗-AB、抗-A1、抗-Lea、抗-Leb单克隆抗体由荷兰Sanquin公司提供。

1.4 抗体筛查及抗体鉴定 按文献［1］方法进行。将被检者血清与筛选细胞采用盐水介质分别在4℃、室温、37℃下进行反应，如有凝集，进一步做抗体鉴定。被检者血清与标准谱细胞反应，在盐水介质和抗球蛋白中试验，同时进行抗-H效价测定。

1.5 流式检测红细胞上A、B抗原 向微孔板中每孔加入约500000个红细胞，0.1%戊二醛室温持续振荡固定10 min，加入抗-A［Sanquin，Pelikloon抗-A(IgM)单克隆抗体］或抗-B［Sanquin，Pelikloon抗-B(IgM)单克隆抗体］，室温持续振荡孵育30 min后，用PBS洗涤3次。加入二抗(phycoerythrin［PE］-labeled rat anti-mouse Ig κ light chain，BD Pharmingen 公司)，室温避光振荡孵育30 min后，洗涤2次。用PBS重悬后，将细胞转移至流式试管中上机检测。采用流式细胞仪(Beckman Coulter，Cytomics FC 500)进行检测，利用 CXP 2.2软件(BECKMAN公司)建立检测方案，用未加荧光抗体的红细胞空白管调节电压，观察红细胞群区域，设门，获取数据。每次实验均设立阴性(O型红细胞)、阳性对照(同型红细胞)。

1.6 外周血基因组DNA提取 用TIANGEN公司的血液基因组DNA提取系统试剂盒提取外周血标本DNA，具体操作参照产品说明书。

1.6.1 ABO基因测序 针对ABO血型基因多态性位点多位于第6、7号外显子，采用蔡晓红等［2］设计的2对引物:5'tggaagggtggtcagagga 3'和5'ctggagaaggagctgggtt 3';5'tgggaagaggatgaagtgaat 3'和5'caacaggacggacaaagga 3'，分别扩增 ABO基因第6外显子和第7外显子DNA片段。PCR产物割胶纯化后，采用美国ABI 3730测序仪进行直接测序。用Chromas软件将测序结果与 NCBI基因文库 A1.01.1.2(GI:156148258)序列进行比对(Blast search)分析。

1.6.2 PCR扩增FUT1和FUT2基因并测序 扩增先证者及家人FUT1基因第4外显子，正向扩增/测序引物和反向扩增/测序引物分别为 Hi7F1(5'-CATTTGCTAATTCGCCTTTCCTC-3')和Hi8R1(5'-GATCAGGCTACATCAGAAAGTCTCC-3')，PCR反应体系及反应循环参数按照参考文献［3］。扩增先证者及家人FUT2基因第2外显子，正向扩增/测序引物和反向扩增/测序引物分别为Sei1F1(5'-CCATCTCCCAGCTA-ACGTGTCC-3')和 See1R7(5'-GGGAGGCAGAGAAGGAGAAAAGG-3')，PCR反应循环参数按参考文献［3］。PCR产物割胶纯化后，采用美国ABI 3730测序仪进行直接测序。用Chromas软件将测序结果分别于与NCBI基因文库NG_007510.1 序列(GI:183076549)和 NG_007511.1 序列(GI:183076550)进行比对(Blast search)分析。

1.6.3 FUT1基因TOPO TA克隆 严格按试剂(美国Invitrogen公司)说明进行操作，挑取10个阳性克隆，提取质粒，以质粒DNA为模板测序鉴定FUT1基因突变。

2 结果

2.1 血型血清学鉴定 2例先证者的血型血清学结果见表1。先证者1的女儿和儿子均为正常B型，无类孟买型;先证者2的女儿和胞姐分别为正常A型和O型，无类孟买型。家系图见图1。吸收放散试验显示，先证者1和先证者2红细胞上均不含有A抗原和B抗原。唾液中和抑制试验证实，先证者1唾液中含有A和B抗原，先证者2唾液中含有A抗原，2者均为分泌型。

表1 2例类孟买血型者的ABO、H、Lewis血型鉴定结果

图1 先证者1和先证者2家系调查示意图

2.2 抗体筛选及抗体鉴定 抗体筛选结果见表2。血清中抗-H效价:先证者1血清抗-H效价分别是:4℃，1∶2;室温，0;37℃，0。先证者2血清抗-H效价分别是:4℃，1∶64;室温，1∶16;37℃，1∶4。

2.3 流式检测红细胞上A、B抗原 通过流式细胞术检测标本红细胞上A抗原和B抗原的表达水平，具体结果见图2。

2.4 ABO基因测序分析 先证者1基因型为A101B101(即261G/G、297A/G、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C和930G/A);先证者2基因型为A101O01(即261G/del杂合)。

表2 2例类孟买血型标本血清与标准谱红细胞反应结果

图2 流式细胞术检测红细胞上的A抗原和B抗原

2.5 FUT1和FUT2基因测序分析 先证者1测序发现FUT1基因存在547～552位 AG纯合缺失(AGAGAG→AGAG)，基因型为h1h1型;先证者儿子和女儿FUT1基因均存在547～552位AG杂合缺失(图3)。先证者2测序发现FUT1基因有2处杂合突变，分别为547～552位AG杂合缺失和658位C→T杂合突变;TA克隆进一步证实1条染色体上FUT1基因存在547～552位AG两碱基缺失，另1条染色体上存在C658T错义突变，基因型均为h1h3。先证者2的女儿和胞姐均存在658位C→T杂合突变(图4)。

图3 家系1的FUT1基因片段测序图

3 讨论

典型的类孟买型为H抗原缺乏分泌型(H基因无活性而SE基因有活性)，其红细胞上ABH抗原缺失，血清中通常存在抗-H或抗-HI，其分泌液中含有正常的ABH物质。有些可通过吸收放散试验测得红细胞上含有少量ABH物质，一般认为可能是因为血浆中的ABH物质吸附到红细胞上所致，并不是红细胞自身表达产生的。。国内已报道的类孟买型个例已超过30例，其中2例是本实验室报道的［4］。本文中2个被检者的血清学试验结果与类孟买ABhm和Ahm血型特点相符。

图4 家系2的FUT1基因片段测序图

在临床工作中，类孟买型常因正反定型不一致，需进行进一步检测而被发现，其红细胞与抗-H试剂反应呈阴性，与抗-A、抗-B、抗-AB反应也呈阴性。这种时候就需要用更敏感、更全面的方法来检测红细胞上的 ABO。近年来有文献［5，6］报道采用流式细胞技术对红细胞表面的ABO抗原进行定量和定性测定，有助于研究人员能够更好地检测抗原的表达量。流式细胞术测定抗原表达的减少是1种敏感方法，因为它可以解决细胞群的问题，测出部分或全部抗原表达的减少，还可以计数涉及的细胞，能更客观和全面地反映红细胞上ABO抗原的表达状况。在ABO血型检测中，流式细胞技术在某种程度上补充了常规血清学和基因检测的不足［6］。本实验室为了更好地检测红细胞上弱表达的A/B抗原，采用了流式细胞术检测红细胞上的ABO抗原。结果显示，流式细胞技术未检测到本研究中2例类孟买型红细胞上的A/B抗原，这和常规血清学试验及吸收放散试验结果相吻合，进一步表明标本红细胞上无A/B抗原表达。这是国内首次用流式细胞技术检测类孟买型红细胞上的A/B抗原。

研究表明，类孟买型主要是由于FUT1基因的突变引起的，目前已报道的相关突变已超40种，包括错义、缺失和插入突变等［7，8］。本研究中的先证者1的FUT1基因第547～552位AG纯合缺失(为h1h1)，为常见的类孟买型，该突变导致阅读框架发生移码，提前形成终止密码，造成第184位到267位氨基酸发生改变，并在氨基酸第268位处合成链被终止，从而突变后的多肽链长度为267个氨基酸，只有野生型的73.2%，且氨基酸序列发生改变，使α1，2岩藻糖基转移酶失去活性，不能合成H抗原［9］。先证者1的女儿和儿子都存在547～552位AG杂合缺失，进一步证实了该突变的存在。测序表明，先证者2存在复合杂合突变，除上述的547～552位AG缺失外，还存在658位C→T杂合突变，TA克隆证实2种突变位于不同的染色体上，为h1h3。C658T错义突变将导致第220位精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)，精氨酸为碱性氨基酸，氨基酸等电点(pI)值为10.76;半胱氨酸为中性氨基酸，pI值为5.07，这2个氨基酸的物理化学性质差异很大，推测这个氨基酸的取代可能降低α1，2岩藻糖基转移酶的生物活性。我们检测了先证者2的胞姐和女儿，都存在658位C→T杂合突变，进一步证实了该突变的存在。

本研究从分子水平和家系调查证实了这2例类孟买型的基因突变位点，但只能推测基因突变对氨基酸的影响，并不能真正反映下游蛋白质的结构与功能关系，因此本研究中发现的2种突变对H抗原的表达以及α1，2岩藻糖基转移酶活性的影响仍有待今后进行体外表达研究。

［1］中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规范.3版.南京:东南大学出版社，2006:246-270.

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［4］许德义，邓刚，黄丹丹，等.两例类孟买型血型的FUT1基因突变分析.中华医学遗传学杂志，2011，28(7):694-698.

［5］Hult AK，Yazer MH，Jörgensen R，et al.Weak A phenotypes associated with novel ABO alleles carrying the A2-related 1061C deletion and various missense substitutions.Transfusion，2010，50(6):1471-1487.

［6］Hult AK，Yazer MH，Jörgensen R.Many genetically defined ABO subgroups exhibit characteristic flow cytometric patterns.Transfusion，2010，50(1):308-323.

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