超高压(等静水压)灭活血浆病毒的研究

周锡鹏 贾培起 马平 吕丽萍 闫舫 张艳宇 肖军 邓江 康琼 许金波(.军事医学科学院野战输血研究所，北京 00850;.天津华泰森淼生物工程技术有限公司)

输血有感染病毒性疾病的风险，虽然血液筛查方法的不断改进大大降低了病毒经输血传播的几率，但由于病毒传播“窗口期”和检测试剂灵敏度的限制，血液输注仍无法保证“零风险”。通过病毒灭活可降低输血风险。目前技术成熟应用较多的是亚甲蓝光化学方法。其他一些方法还处在实验室研究阶段。自1895年Rogar等首次报道了超高压可以杀死微生物以来，有关应用超高压技术的研究报道在国外陆续出现。超高压技术作为1种有效的灭菌消毒的物理手段已成功地应用于食品加工及生物工程的多个领域［1，2］。近年来，时有超高压技术灭活病毒的报道。但主要是围绕灭活病毒与对其免疫原性影响的研究，未见该病毒灭活技术在血液病毒灭活方面的报道。我们就超高压技术按“血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则”的要求，对灭活血浆中模型病毒的灭活条件及灭活效果进行探索性研究。

1 材料与方法

1.1 仪器 超高压试验机，由天津市华泰森淼生物工程技术有限公司与军事医学科学院野战输血研究所联合研制。净化工作台、高压灭菌器、干热灭菌器、CO2恒温培养箱、细菌滤器、离心机、微型震荡器、微量移液器、96孔微量培养板、倒置生物显微镜、日立电子显微镜等。

1.2 病毒与细胞株 伪狂犬病毒(PRV)和辛德毕斯(Sindbis)病毒，为“血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则”中规定的HBV和HCV的指示病毒，水泡性口炎病毒(VSV)为常用的包膜病毒的指示病毒，脊髓灰质炎病毒(PV1)为HAV的指示病毒，猪细小病毒(PPV)为B19的指示病毒。细胞株为Vero、BHK21和PK-15细胞。病毒的毒种均是从中国药品生物制品检定所和中国兽药监察所引入，本实验室传代扩增。

1.3 方法 取正常人血浆按10%的比例分别加入PRV、PRV、VSV、PV1、PPV等指示病毒混匀，留出对照样品。将含病毒血浆装入小型血浆袋中20 mL/袋，排尽气泡，用热合机封口。分别放进超高压试验机的样品仓中，以不同的压力和不同的时间处理样品。处理后的样品和未经超高压处理的对照样按10倍系列稀释，分别加入已接种病毒敏感细胞的96孔微量培养板中，100 μL/孔，每个样品做8个复孔，置5%CO2孵箱中孵育72 h，显微镜下观察并记录各孔细胞病变(CPE)情况。病毒滴度按Karber氏方法计算。

2 结果

2.1 600 Mpa处理不同时间对 PRV、VSV、Sindbis、PV1、PPV病毒的灭活效果 见表1，2。

表1 600Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果

表2 600Mpa处理不同时间对PV1、PPV的无包膜病毒的灭活效果

2.2 500Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果 见表3。

2.3 400Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果 见表4。

2.4 350Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果 见表5。

2.5 300Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果 见表6。

表3 500Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果

表4 400Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果

表5 350Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果

表6 300Mpa处理不同时间对PRV、VSV、Sindbis病毒的灭活效果

2.6 400Mpa处理VSV病毒60min电镜观察对病毒形态的影响 对照病毒为典型的弹状病毒，包膜完整，触须清晰的与病毒体连在一起。经超高压处理的病毒包膜已不完整，触须也从病毒体脱落(图1)。

图1 400Mpa处理VSV病毒60min电镜图

3 讨论

本研究观察了超高压对《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》中规定的几种主要指示病毒的灭活作用。试验结果显示，350Mpa处理含指示病毒的血浆样品90min或400Mpa处理60min可灭活所加入的 PRV、VSV、Sindbis等指示病毒。PRV、VSV、Sindbis等均为脂包膜病毒对超高压灭活处理敏感，而经血液传播的HBV、HCV、HIV等均是脂包膜病毒。所以超高压处理血浆可以阻断这几种主要病毒的血液传播途径。有包膜病毒的包膜是包围在病毒核衣壳外面的双层膜。它主要含有蛋白质、多糖及脂类。包膜是有包膜病毒感染的必须结构。病毒有无包膜对压力的敏感性不同。超高压能改变某些生物高分子物质的空间结构，使之发生不可逆变化。对蛋白质的一、二级结构影响不大，对三、四级的立体结构影响较大。使蛋白质变性、酶失活，导致微生物被灭活［3］。但是用600Mpa超高压处理含PV1、PPV病毒的血浆，对这2种病毒几乎没有灭活作用。PV1、PPV病毒为无包膜病毒，直径小于30nm，衣壳为二十面体立体对称，无包膜。其衣壳主要成分为蛋白质，要使其表面结构发生改变比有包膜的病毒需要更高的压力，即此类病毒对压力因素不敏感。超高压技术用于病毒灭活与常用的光化学技术相比，没有任何外源性物质加入，属于纯物理方法。超高压技术可应用于疫苗的制备。蛋白质的共价键结构完整性是保持免疫原性的必要条件。超高压对病毒的灭活不引起共价结构的改变。有报道显示对不同病毒进行了超高压处理后经免疫动物所产生的抗体同未加压处理的病毒产生的抗体是一样有效的［4］。而且对有包膜病毒来说，经超高压处理的病毒有免疫原性的提高。因为压力可导致原本埋藏在膜内或隐蔽在致密的亚单位结合结构中的抗原位置得以充分暴露［5］。

［1］Bradley DW，Hess RA，Tao F，et a1.Transfusion，2000，40(2):193-200.

［2］Silva J，Foguel D，Royer C.Trends Biochem.Sci，2001，26(10):612-618.

［3］Vadim V.et al.Tibtech dicember，1994，12:493-501.

［4］Elke J urkiewicz，et al.Biophysics，1995，92:6935-6937.

［5］Jerson L.et al.Joural of Virology，1992，66:2111-2117.