食品中木瓜成分实时荧光PCR检测方法

李富威，张舒亚，叶军，谌鸿超，郭云霞，印丽萍

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306）

木瓜，学名番木瓜（Carica papaya Linn.），俗称木瓜，属于番木瓜科番木瓜属，有“百益果王”之称，其果实肉厚清脆，营养全面，含有糖类、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等多种营养成分。近年来，利用我国丰富的木瓜资源，开发生产了大量的木瓜食品，如木瓜饮料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜酱、木瓜粉、木瓜脯等，深受人们的喜爱，消费量急剧增加[1]。为了追求经济利益，一些不法生产者用香精代替原果汁，不含原料成分，使果汁饮料无营养价值，这种制造和出售掺伪造假食品行为损害了消费者利益，扰乱了正常的市场经济秩序[2-4]。大多数食品经过复杂的加工过程，无法通过外观进行鉴别；并且用于掺假的物质多是与其组成接近，或某些性状比较接近的物质，大量的假冒伪劣食品无法通过一些传统的检测鉴伪方法鉴别真假。例如显微鉴定通过观察食品的组织结构、细胞形态以及内含物的特征，鉴定食品真伪适用于保留了原来的动植物组织结构的食品[5]；食品理化成分分析中常用的色谱、质谱、光谱分析等技术很大程度上会受到原料品种、生长环境、加工条件等因素的影响，这些技术或多或少具有一定的局限性[6]。随着分子生物学技术的不断发展，以DNA 为基础的检测方法和手段（如PCR 技术等）具有方便、准确、迅速、简洁的特点，越来越多的应用于食品检测中[7-9]。张舒亚等建立了食品、饲料等动物成分的鉴别研究[10-19]。Palmieri L.等研究实时荧光PCR 方法检测果汁中桔子、草莓、蓝莓、菠萝成分[20]。Jianxun Han 等建立了果汁中葡萄、草莓、苹果、梨、桃成分的PCR 检测方法[21]。

国内外对转基因木瓜（番木瓜）做了大量研究，木瓜蛋白酶PAPAIN 基因作为木瓜内参基因的研究比较成熟。本文选取了文献[22-23]中的两组引物和探针，进行验证、比对，最终建立了食品中的木瓜成分的实时荧光PCR 检测方法。食品和饮料的木瓜等水果成分检测方法的建立对于加强食品标签管理，保护消费者利益，促进进出口和国内市场贸易具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

泰国木瓜、海南木瓜、都乐木瓜、转基因木瓜KY、FP 木瓜购自上海超市。香蕉、枇杷、火龙果、枣、黑布林、苹果、橙子、哈密瓜、猕猴桃、西柚、红毛丹、葡萄、杏子、樱桃、芒果、柠檬、甜瓜、桂圆、石榴、橘子、柿子、蜜梨、水蜜桃、菠萝、大米、黄米、玉米、荞麦、小麦、黄豆、绿豆、白云豆、腰果、花生、马铃薯、海带、芹菜、西红柿、胡萝卜、骆驼、兔、黄牛、猪、驴、羊、马、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、鲫鱼、舌鳎、蓝鳍金枪鱼、带鱼等55 种常见的非木瓜动植物材料样品购自上海超市，用于木瓜成分的特异性检测。

在上海口岸收集进口木瓜6 份，木瓜产品（果汁、果酱）10 份。在国内市场和饭店购买木瓜4 份，产品（木瓜粉、木瓜果酱、木瓜酸奶、木瓜肉酱、木瓜汁饮料等）共30 份，其它未含木瓜成分的样品50 份。用于方法的实际应用。

DP323 动物基因组提取试剂盒、DP305 植物基因组提取试剂盒：天根生化科技有限公司；实时荧光PCR 混合液（Taqman Gene Expression Master Mix）：美国应用生物系统公司。

BioPhotometer plus 核酸蛋白含量测定仪：德国Eppendorf 公司；ABI 7300 实时荧光PCR 仪：美国应用生物系统公司；低温冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

使用冷冻研磨机（SPEX 6850）将上述动植物样品磨成粉状，用于物种特异性检测。

用小麦粉将海南木瓜粉配制成10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%（质量分数）的预混样品，提取DNA，进行重量灵敏度测试。

1.2.2 DNA 提取与制备

使用天根动物基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，目录号：DP323）提取动物样品的DNA，使用植物基因组提取试剂盒（目录号：DP305）提取植物样品的DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。使用BioPhotometer plus 核酸蛋白含量测定仪（Eppendorf）测定核酸浓度。

用1×TE 缓冲液将提取的海南木瓜DNA 溶液稀释为10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL，进行DNA浓度灵敏度测试。

1.2.3 引物和探针序列

引物和探针，由宝生物工程（大连）有限公司合成。引物为PAGE 级，经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化；探针为HPLC 级，经高效液相层析纯化。papain-91-F/papain-91-R引物序列分别为5′-AGTGGCTCAATATGGTATTCACTACAGA-3′和5′-AAAATGTAGATATACCTCCCTTGAG CG-3′，papain-91-P 探针序列为5′-FAM-ATACTTACCCATATGAGGGAGTGCAACGTTATTG-TAMRA-3′。Papain-144-F/Papain-144-R 引物序列分别为5′-GAACTGCTTGACTGCGACAGAC -3′ 和 5′ -GACCTTTCTCCCTTGAGCGAC-3′，Papain-144-P 探针序列为5′-FAMAGCTACGGGTGCAATGGAGGTTACC-TAMRA-3′。

1.2.4 PCR 反应

使用18S rRNA 基因扩增真核生物内源基因，以确保所提取的DNA 适合于PCR 扩增。检测所用18S rRNA 基因引物序列为：5′-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3′和5′-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3′。PCR 反应体系为：1×PCR 缓冲液，2.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq 酶，200 μmol/L dNTPs，引物100 nmol/L，模板50 ng～100 ng，反应体积为25 μL。扩增条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，20 s；54 ℃，40 s；72 ℃，40 s，40 个循环；72 ℃，5 min。

实时荧光PCR 采用25 μL 反应体系：2 ×PCR 反应预混液（ABI Taqman Gene Expression Master Mix，Part No.4369016）12.5 μL，引物（5 μmol/ L）各1 μL，探针（5 μmol/L）1 μL，模板DNA（10 ng～100 ng）1.0 μL，用去离子水补足体系。扩增条件为：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，共40 个循环。

1.2.5 PCR 产物的电泳检测

18S rRNA 基因扩增真核生物内源基因的电泳检测：取10 μL PCR 产物，加1 μL 10×上样缓冲液点样进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2%。

2 结果与分析

2.1 真核生物特异引物18S rRNA 引物的检测结果

用真核生物18S rRNA 特异引物扩增本实验提取的所有DNA 溶液，除5 份未标识含有木瓜成分的果汁（精加工）样品和3 份木瓜汁（精加工）样品外，所提取的DNA 溶液均能出现137 bp 的特异扩增条带。结果表明，5 份未标识含有木瓜成分的果汁（精加工）样品和3 份木瓜汁（精加工）样品未能有效抽提到DNA，其它样品中抽提的DNA 溶液均适合于PCR 测试。

2.2 木瓜成分的特异性检测结果

使用引物与探针papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P，Papain-144-F/Papain-144-R/Papain-144-P对泰国木瓜、海南木瓜、都乐木瓜、转基因木瓜KY、FP木瓜、香蕉、枇杷、火龙果、枣、黑布林、苹果、橙子、哈密瓜、猕猴桃、西柚、红毛丹、葡萄、杏子、樱桃、芒果、柠檬、甜瓜、桂圆、石榴、橘子、柿子、蜜梨、水蜜桃、菠萝、大米、黄米、玉米、荞麦、小麦、黄豆、绿豆、白云豆、腰果、花生、马铃薯、海带、芹菜、西红柿、胡萝卜、骆驼、兔、黄牛、猪、驴、羊、马、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、鲫鱼、舌鳎、蓝鳍金枪鱼、带鱼进行木瓜成分特异性的检测。检测结果显示，经两组引物和探针分别扩增，泰国木瓜，海南木瓜，都乐木瓜，转基因木瓜KY，FP 木瓜均出现明显的扩增曲线，在其余55 个非木瓜物种中均无扩增，检测结果见图1、图2。实验说明这两组引物和探针均有物种特异性。

图1 木瓜引物papain-91-F／papain-91-R 和探针papain-91-P 特异性实时荧光PCR 检测图谱Fig.1 Specific detection of real-time PCR by the papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P primer and probe

图2 木瓜引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P 特异性实时荧光PCR 检测图谱Fig.2 Specific detection of real-time PCR by the papain-144-F/papain-144-R/papain-144-P primer and probe

2.3 木瓜成分的灵敏度检测结果

用小麦粉将海南木瓜粉配制10 %、1 %、0.1 %、0.01%、0.001%（质量分数）木瓜粉样品，并抽提DNA。使用两组引物及探针对木瓜粉不同含量的样品DNA进行检测。结果显示两组引物及探针对10 %、1 %、0.1 %木瓜粉进行检测均出现扩增曲线，而0.01%和0.001%木瓜粉均未出现扩增曲线，检测结果见图3、图4。

图3 木瓜引物papain-91-F/papain-91-R 和探针papain-91-P 重量灵敏度检测图谱Fig.3 Limit of detection by the papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P primer and probe

图4 木瓜引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P 重量灵敏度检测图谱Fig.4 Limit of detection by the papain-144-F/papain-144-R/papain-144-P primer and probe

实验表明，在重量百分比水平上，两组引物及探针的检测灵敏度均为0.1%（质量分数）木瓜粉。

用1×TE 缓冲液将提取的海南木瓜DNA 溶液稀释为10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL，使用两组引物及探针进行实时荧光PCR 扩增检测。结果显示，引物papain-91-F/papain-91-R 和探针papain-91-P 的检测灵敏度为0.01 ng/μL 木瓜DNA，检测结果见图5，引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P 检测灵敏度为0.1 ng/μL 木瓜DNA，检测结果见图6。在DNA 检测水平上，引物papain-91-F/papain-91-R 和探针papain-91-P 的检测灵敏度高于引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P。

2.4 食品中木瓜成分检测的应用

用两组引物及探针对进口和国内市场的木瓜及产品进行实时荧光PCR 检测，6 份进口木瓜和4 份国内市场和饭店的木瓜中，两组引物探针的检测结果均为阳性；对食品标签中注明含木瓜成分的30 个加工食品检测，利用引物papain-91-F/papain-91-R 和探针papain-91-P 进行扩增，在21 个加工食品中检出，检出率为70%，用引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P 进行检测，在18 个加工食品中检出，检出率为60%；两组引物探针对50 份未含木瓜成分的样品检测均为阴性，检测结果见表1。

图5 木瓜引物papain-91-F/papain-91-R 和探针papain-91-P DNA 浓度检测灵敏度图谱Fig.5 Amplification curue generated by serial dilution of papaya DNA by the papain-91-F/papain-91-R/papain-91-P primer and probe

图6 木瓜引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P DNA 浓度检测灵敏度图谱Fig.6 Amplification curue generated by serial dilution of papaya DNA by the papain-144-F/papain-144-R/papain-144-P primer and probe

表1 市售样品检测结果Table 1 Test results of commercial samples

用18S rRNA 引物检测15 份未标识含有木瓜成分的果汁，10 份木瓜汁DNA 出现137 bp 的特异性扩增条带，而在5 份果汁（精加工）样品中未出现特异性扩增条带。用18S rRNA 引物检测8 份木瓜汁样品中发现，5 份木瓜汁DNA 出现137 bp 的特异性扩增条带，而在3 份木瓜汁（精加工）样品中未出现特异性扩增条带，实验表明，在5 份未标识含有木瓜成分的果汁（精加工）样品和3 份木瓜汁（精加工）样品未能有效抽提到DNA，也就不能有效检测木瓜成分。

3 结论与讨论

木瓜蛋白酶PAPAIN 是番木瓜果实特有的蛋白质，在进行转基因木瓜研究时，选择其基因片段作为内参基因研究较多[24-25]。本研究选用文献中根据papain基因设计的两组引物探针引物papain-91-F/papain-91-R 和探针papain-91-P、引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P，进行木瓜成分的实时荧光PCR 检测。本论文使用上述两组引物探针对特异性、敏感性和市售样品检出情况等指标进行了比较研究，选出较好的引物和探针。本研究的试验结果表明两组引物及探针均具有物种特异性，与常见豆类、谷物、蔬菜，水果以及动物均无交叉反应。在重量百分比水平上，两组引物及探针的检测灵敏度均为0.1%（质量分数）木瓜粉。在DNA 浓度灵敏度的测试中，使用引物papain-91-F/papain-91-R 和探针papain-91-P 比引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P 检测灵敏度要高。在对市售商品检测时，使用引物Papain-144-F/Papain-144-R 和探针Papain-144-P 的检出率比引物papain-91-F/Papain-91-R 和探针papain-91-P 略低。2 组引物探针均能应用于食品中木瓜成分检测。

在不含果肉的精加工木瓜果汁中未能成功提取出木瓜DNA，因木瓜果汁中DNA 的含量相对较少，果汁加工要经过若干加工工序对DNA 有降解作用，DNA 的提取有一定难度，需要对其提取方法作进一步研究。

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