微囊藻毒素-LR对SD大鼠的短期毒效应研究

李秀娣，毛光明

（1.杭州市标准化研究院，浙江杭州 310005；2.浙江省疾病控制中心，浙江杭州 310051）

微囊藻毒素（microcystin，MC）是一类主要由蓝藻产生的一类环状七肽的肝毒素[1]，其毒性作用的靶器官为肝脏，可导致肝细胞损伤，并提高肝癌的发病率[2]，近年来有研究表明，该毒素亦可特异性分布于肾脏，并可能产生肾毒性[3]。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是最为常见的一类。微囊藻毒素广泛分布于我国淡水水系中，水体中MC-LR 总含量通常在0.1 μg/L～1 μg/L，水华大量腐败消解时，最大可在80 μg/L～90 μg/L 左右[4]。该毒素可以通过淡水水生生物富集进入食物链，间接危害人类健康[5]。同时，该毒素亦可污染饮用水源[6-7]。由于该毒素结构稳定，能抵抗pH 变化和高温，且不易被沉淀和吸附[8-9]，因此，饮用水中去除MC-LR是非常困难的。目前尚未有实验室条件下关于短期直接饮用含不同剂量MC-LR 的饮用水导致实验动物肝脏和肾脏损伤的研究。

本实验通过对SD 大鼠的饮用的蒸馏水中添加低毒和高毒剂量的纯MC-LR，观察不同剂量的MC-LR对脏器系数、肝肾功能和氧化应激相关指标的影响，探索MC-LR 污染饮用水后，对机体损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

200 g 左右的SD 大鼠：浙江省实验动物中心。

微囊藻毒素（MC-LR）：美国Sigma 公司；丙二醛（MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、过氧化氢酶（CAT）测试盒：上海工硕生物技术有限公司。

7600 全自动生化分析仪：日本Hitachi 公司；UV754 型紫外可见光分光光度计：上海光谱仪器有限公司；LG10-2.4A 型离心机：北京医用离心机厂；D-37520 低温高速离心机：Thermo，德国。

1.2 方法

1.2.1 饮用水中MC-LR 对大鼠毒性模型的建立

饮用水中MC-LR 对大鼠毒性的实验模型，如表1所示。

表1 饮用水中MC-LR 对大鼠毒性的实验模型Table 1 The SD rat model for toxicity effect testing of MC-LR

选用SD 大鼠54 只，按表1 随机分为9 组，每组6 只。将MC-LR 溶于大鼠的日常饮用的蒸馏水中至质量浓度为8 μg/L（低毒组）和80 μg/L（高度组）；对照组不加MC-LR，用以喂养大鼠2 周。在实验期间，动物自由进食进水，室温保持在（20±1）℃，湿度为（45±10）%，并保持12 h 的昼夜循环。

1.2.2 样品采集

各组分别在给药后的1、7 和14 d 处死前称重。

开腹，腹主动脉取血法采血，部分取全血置于肝素处理的离心管中，其余置于普通离心管中析出血清；指标检测前，所有血液样本均3 000 r/min 离心，取上清测定。取血完毕后立即处死大鼠，分离出肝、肾，用于后续测定。

1.2.3 脏器系数的测定

分离出肝、肾后，立即于分析天平上称质量，计算大鼠肝脏和肾脏系数。

1.2.4 肝肾功能的测定

运用全自动生化分析仪采用酶促反应速率法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），碱性磷酸酶（ALP），肌酐（Cr），尿素氮（BUN）。

1.2.5 氧化应激相关指标的测定

采用试剂盒方法测定血清SOD，CAT 活性和MDA含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 大鼠体重增长情况

口服MC-LR 对大鼠体重增长情况的影响，见表2。

表2 口服MC-LR 对大鼠体重增长情况的影响（n=6）Table 2 The effects of MC-LR on the weights of SD rats（n=6）

实验期间未出现动物意外死亡。如表2 所示，饲养后第1 天，三组体重差异没有统计学意义（P＞0.05）。饲养后第7 天和第14 天，低毒组动物体重与对照组比较，无差异（P＞0.05）。但高毒组动物体重与对照组和低毒组比较，体重增长明显减缓，差异有极显著统计学意义（P＜0.01）。

2.2 口服MC-LR 对脏器系数的影响

口服MC-LR 对大鼠脏器系数的影响，见表3。

根据表3 可知，饲养后第1 天，3 组肝脏系数和肾脏系数之间，差异没有统计学意义（P＞0.05）。低毒组饲养后第7 天和第14 天，肝脏系数和肾脏系数与对照组相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）。高毒组饲养后第7 天和第14 天后，肝脏系数和肾脏系数较对照组和低毒组极显著增加（P＜0.01）。

表3 口服MC-LR 对大鼠脏器系数的影响（n=6）Table 3 The effects of MC-LR on the organ function of SD rats（n=6）

2.3 口服MC-LR 对肝脏酶学指标ALT、AST 和ALP的影响

口服MC-LR 对肝脏酶学指标的影响，见表4。由表4 可知，对照组饮用蒸馏水，各时间点之间肝功能指标无显著改变（P＞0.05）。饲养后第1 天，三组的肝脏酶学指标，差异没有统计学意义（P＞0.05）。饲养后第7 天和第14 天后，低毒组各项指标，较对照组均有所升高，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。高毒组的ALT，AST 和ALP 指标出现极显著增加（P＜0.01），并且随着时间的推移，高毒组各项指标呈极显著增加趋势（P＜0.01）。

表4 口服MC-LR 对肝脏酶学指标的影响（n=6）Table 4 The effects of MC-LR on the liver function of SD rats（n=6）

2.4 口服MC-LR 对肾脏酶学指标CR 和BUN 的影响

口服MC-LR 对肾脏酶学指标的影响，见表5。

表5 口服MC-LR 对肾脏酶学指标的影响（n=6）Table 5 The effects of MC-LR on the kidney function of SD rats（n=6）

根据表5 的统计学结果，对照组饮用蒸馏水，各时间点之间肾脏酶学指标无显著改变（P＞0.05）。饲养后第1 天，三组的肾脏酶学指标，差异没有统计学意义（P＞0.05）。饲养后第7 天和第14 天，低毒组各项指标，较对照组均有所升高，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。高毒组的与对照组和低毒组相比，CR 和BUN极显著增加（P＜0.01），且随着时间的推移，高毒组各项指标明显升高（P＜0.05）。

2.5 口服MC-LR 对大鼠血清抗氧化活性的影响

口服MC-LR 对氧化应激相关指标的影响，见表6。

表6 口服MC-LR 对氧化应激相关指标的影响（n=6）Table 6 The effects of MC-LR on the oxidative stress of SD rats（n=6）

如表6 所示，对照组饮用蒸馏水，各时间点之间血清中过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量基本没有变化（P＞0.05）。低毒组的CAT，SOD 在饲养后第1 天，7 天和14 天较对照组出现极显著升高；高毒组的CAT，SOD 在饲养后第1 天和第7 天较对照组出现极显著升高；氧化应激代谢产物，丙二酸（MDA）低毒组在饲养后第7 天出现显著增加（P＜0.05），低毒组在饲养第14 天，高毒组在饲养后第7 天和第14 天出现极显著增加（P＜0.01）。

随着时间变化，低毒组CAT 值在饲养第7 天较第1 天显著升高（P＜0.05），但第14 天变化不大。高毒组CAT 值在饲养第7 天较第1 天极显著升高（P＜0.01），但第14 天较第1 天和第7 天都出现极显著降低（P＜0.01）。低毒组SOD 值饲养后的各时间点未出现显著改变（P＞0.05）。高毒组SOD 值在饲养第7 天较第1 天极显著升高（P＜0.01），但在饲养第14 天较第1 天和第7 天极显著降低（P＜0.01）。高毒组和低毒组MDA 值在饲养后的各时间点都呈极显著升高趋势（P＜0.01）。

3 讨论

本实验采用蒸馏水添加MC-LR 的方法对大鼠进行饲喂，研究SD 大鼠在短期持续性暴露MC-LR 后机体损伤的情况和损伤机制。经过7 天和14 天的暴露后，低毒组生长状况良好，肝肾系数未出现显著改变。说明低浓度MC-LR 的短期持续暴露对肝肾影响较小，不引起肝脏和肾脏的质量增加。高毒组大鼠的体重增加出现明显抑制，并且肝肾系数出现了显著增加，说明对高浓度MC-LR 的短期持续性暴露会导致肝脏和肾脏发生了出血和肿胀等反应[10-11]，引起肝肾质量增加，解毒功能失代偿，进而影响到大鼠摄食和体重增加。

通过对实验动物肝肾功能的监测，低毒组的肝功能酶学指标ALT，AST 和ALP 以及肾功能指标CR 和BUN 在观测期间均未出现显著异常，说明大鼠的肝脏和肾脏在对MC-LR 的低浓度短期持续暴露的损伤是可修复或者可代偿的，因此未导致功能性的损伤。然而当对MC-LR 进行高浓度短期持续暴露，就会导致肝肾功能严重受损。高毒组出现肝功能酶学指标和肾功能指标极显著增加，表现出功能性的失代偿。且这种损伤是难以修复的，表现为随着时间的推移，肝肾功能指标进行性的增加。这一表现说明了短期高浓度持续暴露MC-LR 之后，肝肾功能的损伤会加重和不可逆。短期高浓度持续暴露之后，MC-LR 存在蓄积效应，可以推测，当低浓度长期暴露的话，蓄积到一定的剂量，会引起类似的损伤。也说明实验动物对大剂量的MC-LR 的接触缺乏良好的解毒机制。

CAT、SOD 是生命体在自我保护过程中两种非常重要的生物活性物质，多存在于过氧化物酶体内；是机体消除在新陈代谢和损伤修复过程中产生的氧自由基，对抗和阻断氧自由基对细胞造成损伤的重要的抗氧化剂[12]。当这两种物质的活性受到抑制，就会出现氧化应激产物MDA 生成的增加。因此，CAT 和SOD 活性可间接反应机体清除自由基的能力。而MDA 是氧自由基攻击细胞膜中不饱和脂肪酸后形成的脂质过氧化物，MDA 的水平可以间接反映细胞膜损伤的程度[13-14]。

本实验表明，当短期低浓度接触MC-LR 之后，机体的CAT 和SOD 活性都出现显著性的升高，随着时间的推移，CAT 先增加而维持不增，而SOD 保持相对稳定的水平，说明CAT 比SOD 的敏感性高。在接触初期，MDA 水平保持不增，但随着时间的推移，MDA 出现极显著性增加。说明在短期低浓度持续性接触MCLR 后，机体自身的抗氧化系统不足以对抗MC-LR 对细胞的损伤，尽管肝肾功能未出现显著性异常，但细胞的损伤还是存在的。可以推测继续长期接触的话，将会导致肝细胞的反复损伤，进而可能导致肝肾功能的失代偿，甚至肝癌的发生，研究也表明，在肝癌高发地区的水源中可检出高含量的微囊藻毒素[15-17]。

当短期高浓度持续接触MC-LR 之后，机体的CAT和SOD 活性先出现极显著升高，接着出现抑制，这种抑制的程度，极显著的低于正常活性范围。同时，MDA 水平出现极显著的增加，并同时伴有肝肾功能的严重受损。持续暴露于高浓度的MC-LR 环境，会导致机体的抗氧化系统受到抑制，从而出现了机体的失代偿。

本实验得出的结果表明，短期持续低浓度接触MC-LR 对机体的抗氧化系统影响较小，机体可以在一定程度上代偿并恢复肝肾细胞的损伤，因此肝肾功能可不出现的异常。但短期持续高浓度接触MC-LR 之后，机体的抗氧化系统将受到抑制，机体无法代偿并出现严重的肝肾功能损伤，MC-LR 对机体的毒性存在蓄积效应，生物体若长期持续暴露于MC-LR，将引起机体肝肾功能的失代偿。因此有必要加强对饮用水中MC-LR 的监测和清除工作。

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