冬虫夏草发酵培养基的优化

殷海松，乔长晟，秦韶燕，汤卫华，贾士儒

（1.天津现代职业技术学院，天津 300350；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；3.瑞奇外科器械（中国）有限公司，天津 300457）

冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。主要分布于青海、西藏、四川、云南、甘肃、贵州等地高寒地带和雪山草原等省区[1-2]。

冬虫夏草具有具有补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮等功效等功效。虫草多糖、虫草酸和虫草素是冬虫夏草的主要活性物质[3]。但由于过度采集，自然界中野生虫草越来越少，而且价格很高。冬虫夏草液体发酵培养，国内外均有很多研究报道，并有一系列药品和保健食品在市场上销售，而且经多年的临床使用，冬虫夏草人工菌丝制品的药理作用与天然冬虫夏草几乎一致[4]，个别有益指标高于天然冬虫夏草，但其价格要远远低于天然虫草。因此通过冬虫夏草液态发酵获得菌丝体和代谢产物非常有实际价值。

本文采用单因素试验法，优化了冬虫夏草发酵培养基，从而一定程度上提高了冬虫夏草生物量和胞外多糖产量。

1 材料和方法

1.1 菌株

冬虫夏草（Cordyceps sinensis.）：天津科技大学生物工程学院保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面种子培养基：PDA 培养基。

1.2.2 发酵培养基（g/L）

培养基（A）：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO·47H2O 1.5 g/L 和土豆200 g/L。

培养基（B）：葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO·47H2O 0.5 g/L[5]。

培养基（C）：葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO·47H2O 0.5 g/L[6]。

培养基（D）：葡萄糖40 g/L、黄豆粉40 g/L、酵母膏5 g/L、KH2PO42.5 g/L、MgSO·47H2O 1.5 g/L[7]。

1.3 仪器与设备

UV-2401 紫外可见分光光度计：日本SHIMADZU公司；FA2004 电子天平：上海精科天平；梅特勒FiveGo便携式pH 计：瑞士梅特勒托利多；DGG 型电热鼓风干燥箱：天津天宇机电有限公司；LD5-10 型低速离心机：北京医用离心机厂；YHG-Ⅱ迴转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司。

1.4 测定方法

1.4.1 生物量的测定

(4)实现网络物联网服务器集数据采集、汇集为一体，可以独立记录单点居室数据，未来推广后也可做为汇聚层收集多个居室，跨区域居室的数据，有效了解城市不同区域内环境情况，提供环境大数据分析参考依据。

取20 mL 摇瓶培养液，离心机4 000 r/min 离心20 min，除去上清夜，水洗、再离心，重复3 次。收集菌丝体，60 ℃烘干至恒重，在干燥器中冷却到常温，称量。

1.4.2 冬虫夏草胞外多糖的提取与测定方法

1.4.2.1 胞外多糖的提取方法

将发酵液于4 000 r/min 离心20 min，得菌丝体和上清液；将上清液减压浓缩或常压蒸发浓缩，浓缩温度不超过100 ℃，得黏稠状液体；浓缩液加入2 倍体积的95%的乙醇醇析，其醇析时间不低于24 h，获得白色纤维状沉淀；将沉淀离心，沉淀用75%的乙醇洗涤数次；在60 ℃烘干，得灰白色粗多糖。

1.4.2.2 粗多糖的测定

将经干燥至恒重的粗多糖直接用分析天平称重。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养基的筛选

以4 种不同培养基为初始发酵培养基时，冬虫夏草在培养过程中生物量和胞外多糖随时间变化的曲线如图1 所示，从图1（a）中可知，冬虫夏草在以培养基（A）作为发酵培养基时细胞生长要好于其它3 种培养基，获得最大细胞干重为18.56 g/L。胞外多糖随时间变化曲线如图1（b）所示，从图1（b）中可知，冬虫夏草在以培养基（A）作为发酵培养基时获得了最大胞外多糖产量1.89 g/L，胞外多糖产量明显高于其它3 种培养基。综合考虑菌体量和胞外多糖产量，以培养基（A）做为冬虫夏草液态发酵的初始培养基。

图1 发酵培养基对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响Fig.1 Effects of fermentation mediums on cell growth and EPS production in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

2.2 发酵培养基的优化

2.2.1 碳源对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响

图2 碳源对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响Fig.2 Effects of carbon source on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks.

冬虫夏草细胞生长的动态变化过程如图2（a）所示，当以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖为初始碳源时获得 最 大 细 胞 干 重 分 别 为17.405、17.015、10.870 和16.025 g/L，结果表明以葡萄糖为初始碳源时获得的细胞干重最大，乳糖获得的细胞干重最小。冬虫夏草胞外多糖生产的动态过程如图2（b）所示，当以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖为初始碳源时获得最大胞外多糖产量分别为1.82、1.66、1.564 和1.96 g/L，从图中可知麦芽糖最有利于胞外多糖生产，葡萄糖次之。72 h 之前，胞外多糖与细胞生长呈一定的相关性，随着菌体细胞生长，胞外多糖也相应增加72 h 以后，细胞生长和胞外多糖生产有一定的背离（乳糖例外）。虽然麦芽糖最有利于胞外多糖生产，但是使用麦芽糖做碳源，成本太高，不适合大规模生产，所以综合考虑生物量和胞外多糖的产量，确定最适碳源为葡萄糖。

2.2.2 葡萄糖起始浓度对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响

葡萄糖起始浓度对虫草菌细胞生长的影响如图3（a）所示。当葡萄糖起始浓度为10、20、30、40 g/L 时，获得的细胞干重分别是14.05、19.23、21.68、20.52 g/L。相应的细胞平均生长速率分别为2.299、3.163、3.613、3.420 g/（L·d）。结果表明当葡萄糖起始浓度为30 g/L时获得了最大的细胞干重21.68 g/L 和细胞平均生长速率3.613 g/（L·d）。葡萄糖起始浓度对冬虫夏草胞外多糖生产的影响如图3（b）所示。当葡萄糖起始浓度为10、20、30、40 g/L 时，获得最大胞外多糖产量分别为1.301、1.840、2.054、2.174 g/L。

图3 葡萄糖起始浓度对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响Fig.3 Effect of initial glucose concentration，i.e.10，20，30，40 g/L on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis

所以综合考虑生物量和胞外多糖的产量，确定最适葡萄糖起始浓度为30 g/L。

2.2.3 氮源对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响

图4 氮源对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响Fig.4 Effects of nitrogen source on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

冬虫夏草细胞生长的动态变化过程如图4（a）所示，在起始氮源分别为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸铵时，获得了最大的细胞干重，分别为23.10、22.25、21.28、16.12 g/L。从图中可知以蛋白胨为氮源时获得了最大的细胞干重23.10 g/L，以硫酸铵为氮源时获得的细胞干重最小16.12 g/L。从图4（a）中可知在培养前期以硫酸铵为氮源时菌体生长要快于其它3 种有机氮源，这是因为微生物对无机氮源的利用一般比有机氮源快[8]。但是培养到72 h 后其它3 种有机氮源的细胞生长要明显快于硫酸铵，这是因为有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类，脂肪，无机盐，维生素及某些生长因子，尤其是其中的某些生长因子可能会促进菌体细胞生长和代谢产物合成。冬虫夏草胞外多糖生产的动态过程如图4（b）所示，在起始氮源分别为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸铵时，获得了最大胞外多糖产量分别为2.230、1.522、1.558、1.074 g/L。当以蛋白胨为氮源时获得的胞外多糖产量最大2.230 g/L，以硫酸铵为氮源时获得的胞外多糖产量最小1.074 g/L，这可能是蛋白胨中含有的某些生长因子有利于胞外多糖的生产。

所以综合考虑生物量和胞外多糖的产量，确定最适氮源为蛋白胨。

2.2.4 蛋白胨起始浓度对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响

蛋白胨起始浓度对冬虫夏草细胞生长的影响如图5（a）所示，当蛋白胨起始浓度为5、10、15 g/L 和20 g/L 时，获得的最大细胞干重分别为18.800、22.840、24.995 和23.795 g/L。结果表明当蛋白胨起始浓度15 g/L 时获得了最大细胞干重，起始浓度5 g/L 时获得的细胞干重最小。蛋白胨起始浓度对冬虫夏草胞外多糖生产的影响如图5（b）所示，当蛋白胨起始浓度为5、10、15 g/L 和20 g/L 时，获得的最大胞外多糖产量分别为2.069、2.338、2.802 和2.796 g/L。结果表明当蛋白胨起始浓度15 g/L 时更有利于冬虫夏草胞外多糖的生产。

图5 蛋白胨起始浓度对冬虫夏草细胞生长和胞外多糖生产的影响Fig.5 Effect of initial peptone concentration,i.e.5，10，15，20 g/L on cell growth（c）and EPS production（d）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

所以综合考虑生物量和胞外多糖的产量。以15 g/L作为发酵培养基的起始氮源浓度。

3 结论

通过单因素试验确定冬虫夏草液体发酵的最优培养基为：葡萄糖30 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO4.7H2O 1.5 g/L 和土豆200 g/L。采用最优发酵培养基，在摇瓶培养条件下，获得的最大生物量和最大胞外多糖产量分别为24.99 g/L 和2.80 g/L，比优化前分别提高了34.6%和48.1%。

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[2]毛先兵.深层培养药用蕈菌蛹虫草生产虫草素的研究[D].上海：华东理工大学,2004

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[6]张巧霞.冬虫夏草菌抗肿瘤活性及其作用机理的研究[D].天津：天津大学,2005

[7]余晓斌,罗长才,缪静.pH 值对冬虫夏草深层发酵的影响[J].食品与发酵工业,2002,29(3)：98-100

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